降低血磷水平的人FGF23蛋白质突变体制造技术

分离编码人ＦＧＦ２３蛋白质的全长ｃＤＮＡ，在此ｃＤＮＡ上有单个氨基酸替代的突变体，其为诱变法所构建。这些突变体于体内表达时，具有降低血磷水平的作用。人们希望这些突变体及其编码ＤＮＡ可作为高磷酸盐血症的药物治疗剂，或其基因治疗的药物治疗剂。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及降低血磷水平的FGF23蛋白质突变体及这些突变体的用途。
技术介绍
FGF23是一种由Ito等在Kyoto大学克隆的基因，其在脑中表达已被确认(Yamashita T.et al.(2000)Biochem.Biophy.Res.Commun.277494-498；WO01/66596)。进一步地，Luethy等已克隆FGF23基因以生产可表达此基因的转基因小鼠并分析该小鼠的表型(WO01/61007)另外，基于对患有佝偻病(一种先天性低磷酸盐血症)的病人的基因谱分析，报道此病是由于FGF23的突变(R176Q，R179Q，R179W)造成(The ADHRConsortium(2000)Nat.Genet 26345-348)。然而，此报道既未提及获得了蛋白质或全长cDNA，也未提及前述观察到的FGF23基因突变与低磷酸盐血症之间的因果联系。
技术实现思路
本专利技术是鉴于前述观察资料完成的。本专利技术的目的特别包括了提供降低血磷水平的FGF23蛋白质突变体，编码这些突变体的DNA和这些突变体及DNA的用途。本专利技术者为达到前述目的进行了广泛的研究，目的在于获得希望降低血磷水平的FGF23蛋白质的突变体。首先分离人FGF23基因的全长cDNA，然后用PCR技术合成编码突变体的DNA并克隆入表达载体。经由静脉内给药将此表达载体导入小鼠以在其体内表达此突变体，其后检测小鼠的血磷水平。结果表明由于FGF23突变体的表达，小鼠的血磷水平显著降低。特别是，除成功制备出FGF23蛋白质突变体外，本专利技术者还用这些突变体成功降低了小鼠的血磷水平，最后达到了本专利技术的目的。因为本专利技术的FGF23蛋白质突变体能如前述降低血磷水平，所以人们十分希望它们可用做治疗高磷酸盐血症的药物。本专利技术涉及降低血磷水平的FGF23蛋白质的突变体，编码这些突变体的DNA和这些突变体及DNA的用途。更为具体地，本专利技术提供了(1)一种DNA，编码含有氨基酸序列为SEQ ID NO2的蛋白质，此氨基酸序列含有选自如下的突变位置176的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置179的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置179的精氨酸突变为色氨酸。(2)一种编码包含蛋白质的至少1到190位氨基酸序列的片段的DNA，该蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO2，该序列含有选自如下的突变位置176的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置179的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置179的精氨酸突变为色氨酸。(3)一种载体，其中插入了根据权利要求1或2的DNA。(4)一种转化细胞，其包含根据权利要求1或2的DNA或根据权利要求3的载体。(5)一种含有氨基酸序列为SEQ ID NO2的蛋白质，该序列含有选自如下的突变位置176的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置179的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置179的精氨酸突变为色氨酸。(6)一种含有蛋白质至少其位置1到190的氨基酸序列的片段，该蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO2，该序列包含选自如下的突变位置176的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置179的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置179的精氨酸突变为色氨酸。(7)一种制备根据权利要求5或6的蛋白质的方法，其包括培养根据权利要求4的转化细胞的步骤和从此转化细胞或其培养上清收集表达蛋白质的步骤。(8)一种降低血磷水平的药物组合物，其包含根据权利要求1或2的DNA，根据权利要求3的载体或根据权利要求5或6的蛋白质。(9)权利要求8的药物组合物，其不影响血钙水平。(10)权利要求8或9的药物组合物，用于治疗高磷酸盐血症。(11)一种治疗高磷酸盐血症的方法，包括向患者给药根据权利要求1或2的DNA的步骤。本专利技术提供编码降低血磷水平的FGF23蛋白质突变体的DNA。本专利技术DNA所编码的这些突变体包含SEQ ID NO2的人FGF23蛋白质氨基酸序列上位置176上的精氨酸为谷氨酰胺取代的突变体，位置179上的精氨酸为谷氨酰胺取代的突变体和位置179上的精氨酸为色氨酸取代的突变体(在下文中，这些突变体分别被称为“R176Q突变体”，“R179Q突变体”和“R179W突变体”，并且它们所有都被称为“FGF突变体”)。在这些突变体中，R176Q突变体和R179Q突变体是优选的，并且R179Q突变体是最优选的。本专利技术也提供了这些FGF突变体的片段。优选片段至少含有从FGF突变体位置1到190的氨基酸序列。本专利技术的这些FGF23突变体能够降低血磷水平。因此，人们希望能用这些FGF23突变体对由于血液中磷水平高而引起的疾病起到治疗和预防的效果。根据本专利技术的优选实施方案，FGF23突变体不会影响血钙水平。人们期待能够对此发挥治疗和预防效果的疾病实例是高磷酸盐血症。高磷酸盐血症通常由于肾脏分泌的PO4降低而发生。进行性(advanced)肾衰(肾小球滤过率(GFR)低于20mL/min)会造成足以导致血浆PO4升高的分泌降低。即使没有肾衰的病因，假性甲状旁腺功能衰退或甲状旁腺功能衰退也可能会引发肾脏PO4分泌紊乱。由于口服用药PO4过量或有时含磷酸盐的灌肠剂的应用过量同样会造成高磷酸盐血症。而且，高磷酸盐血症会作为细胞内PO4迁移到细胞外的结果出现。此种迁移常在糖尿病酮症酸中毒(不考虑全身PO4丢失)，瘀伤，无创伤性横纹肌溶解，全身感染和肿瘤溶解综合症中出现。并且，高磷酸盐血症在继发性甲状旁腺功能衰退的发作和长时间接受透析治疗的病人其肾性骨营养不良的发作中起到重要作用。本专利技术的DNA用于体内和体外制备本专利技术下面所描述的突变体。另外，它们可用于基因治疗由于血磷水平高引起的疾病。本专利技术的DNA可呈现任何形式，只要它们编码本专利技术的突变体。例如，DNA可为由mRNA合成的cDNA，为基因组DNA或经由化学合成。而且，基于遗传密码简并性而具有主观核苷酸序列的DNA包含在本专利技术的DNA中，只要它们编码出此专利技术的突变体。本专利技术的DNA可通过修饰人FGF23 cDNA而制成。此种人FGF23cDNA可以用业内人士已知的方法来制备。例如，其可通过从表达FGF23的细胞制备cDNA文库再用FGF23 cDNA序列(SEQ ID NO1))的部分作为探针进行杂交。例如，cDNA文库可用文献(Sambrook，J.et al.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))描述的方法制备，或应用商品化的DNA文库。进一步，文库可如下制备(1)从表达FGF23的细胞制备RNA；(2)用逆转录酶合成cDNA(3)合成一段基于FGF23 cDNA序列(SEQ ID NO1)的寡DNA；并且(4)用此寡DNA作为引物进行PCR以扩增编码本专利技术多肽的cDNA。更为具体地，mRNA可以首先从表达FGF23的细胞，组织或器官中分离，已知方法可用于分离mRNA。例如，总RNA可用胍超速离心(ChirgwinJ.M.et al.，Biochemistry 185294-5299(1979))或用AGPC法(Comczynski P.和Sacchi n.，Anal.Biochem.162156-159(1987)制备，mRNA则可用一种mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)纯化自总RNA，等等。或者，mRNA可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ，编码含有氨基酸序列为ＳＥＱＩＤＮＯ：２的蛋白质，此氨基酸序列含有选自如下的突变：位置１７６的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置１７９的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置１７９的精氨酸突变为色氨酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：伊藤浩孝，福岛直，斋藤一史，草野健一郎，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]