检测翻译后修饰活性的方法及实施该方法的装置系统制造方法及图纸

本发明专利技术涉及一种在来自生物体细胞或具有测试化学药品的小液体样品中定性检测翻译后修饰活性的方法。作为翻译后修饰的实例，可提及通过激酶和磷酸酶的蛋白质的磷酸化－去磷酸化。所述方法的特征在于，合成蛋白质片段或多肽作为传感器。所述蛋白质片段或多肽由含有带电荷的氨基酸残基的部分１和２以及具有一个或多个修饰残基（Ｘ）的识别位点组成。因此，该传感器具有特殊的静电势分布和偶极矩。通过添加酶来进行传感器的修饰，这与分子的静电势分布的偏移以及偶极矩的变化是相关的。电势偏移是翻译后修饰活性的一个证据。建议可以使用多种不同的装置系统来实际施行该方法。本发明专利技术提供了一种快速、高度灵敏且有效的用于检测不同类型的翻译后活性的方法，该方法特别适合用于生物学多检测系统（生物芯片和高通量筛选）的领域，和特别是用于药物开发、医学诊断、基础研究和环境保护。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种定性检测翻译后修饰活性的方法，即检测酶活性，所述酶活性通过形成特殊的基团如磷酸基团来修饰已经合成的蛋白质并改变其功能。出现严重疾病如癌症、糖尿病、关节炎、心血管循环疾病、高血压和中风的原因是改变的蛋白质活性。本专利技术提供了一种快速、高度灵敏且有效的用于检测不同类型的翻译后活性的方法。用本专利技术的方法和装置系统，在生物学多检测系统的领域中对于所需测试的高通量(Hochdurchsatz)作出了重要的贡献。在说明现有技术的更详细的实施方案之前，应当确认下列事实作为开场白用于快速检测具有生物活性的分析物的系统和方法(特别是在小液体样品中)具有高的医学和制药学意义以及环境保护意义。最全面和意义最重大的、对于药物开发特别重要的细胞活性类别之一是在翻译后修饰中起作用的活性。这些对于每个细胞为特征性的活性的结果是改变了经修饰的蛋白质的功能特性。蛋白质或多肽的翻译后修饰的主要机制是磷酸化、甲基化、异戊二烯化、遍在蛋白化和蛋白水解。不同的外部条件(刺激)，例如生长因子的存在或病理状态的发展如细胞周期的变化以及毒素的作用，可以短暂地改变多种细胞内组分的翻译后状态。因此，快速开发出特定翻译后活性的特异且有效的抑制剂或激活剂是必需的。就这点而言，开发相应的样品和方法是重要的，这些样品和方法使得能够在多检测系统(微阵列，生物芯片)中可靠而灵敏地检测这些活性。通过激酶和磷酸酶的蛋白质的磷酸化-去磷酸化可作为翻译后修饰的实例。激酶通过将磷酸基团连接至氨基酸残基(主要是丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)之上(磷酸化)来修饰蛋白质。与此相反，蛋白磷酸酶去除这些磷酸基团，因此反转了磷酸化效果。蛋白质磷酸化状态的变化在活细胞中通过局部化和蛋白质之间的分子相互作用调节着酶活性。细胞中激酶和磷酸酶活性之间的总平衡是在每个时间点上蛋白质磷酸化状态的基础。一般认为，蛋白激酶和磷酸酶的作用属于蛋白质功能的最重要的调节机制。最新的对于疾病的认识和分析指向蛋白激酶的遗传检测，其可指明超过400种特殊的疾病状态，这些疾病状态本身被认为与改变的激酶活性相关。因为异常的蛋白质磷酸化是出现严重疾病如癌症、糖尿病、关节炎、心血管循环疾病、高血压和中风的原因，所以对于制药工业来说感兴趣的是能够抑制蛋白激酶的磷酸化活性的新型化合物。为了开发出新型的有效药物，必需测试借助于组合化学合成的大量的化合物。为此目的，制药工业需要使得能够以高通量规格进行所需的测试的新技术。此外，还为了改善已经开发出的药物的作用，必需检验这些药物在多大程度上影响着蛋白激酶和磷酸酶的活性。例如环孢菌素是一种免疫系统抑制剂，没有这种物质就无法进行器官移植。最近更新的研究才表明，该药剂的作用机制是通过抑制蛋白质磷酸酶PP2B而起作用的。现有技术的详细说明本身已知的生物芯片技术是一种非常有效的方法，其对于医学诊断和药物开发带来了革命性的改变。使用基因芯片例如能够在一次试验中容纳肿瘤或其他组织的全部的转录样本。基因芯片的开发和制备已经到了后期。改变的蛋白质活性如上所述是严重疾病的原因，这种蛋白质活性的变化是借助于基因芯片无法探查到的。因此需要开发出有效的蛋白质芯片技术(以多检测规格快速评测改变的蛋白质活性的方法)。由于蛋白质芯片技术的高度复杂性，这种技术目前只能有限地进行使用。国际上的现有技术状态当前的激酶活性的检测方法通常基于通过在蛋白质底物中嵌入放射性磷酸32P的测量。在使用这种方法时，必须对于细胞使用非常高剂量的放射活性，以便标记整个的细胞内ATP库和确保目标蛋白质的放射活性标记。为了检测目标蛋白质的相对磷酸化，必须在将细胞与测试物质进行温育之后裂解细胞并纯化目标蛋白质。该方法需要大量的细胞、长的温育时间和小心的处理操作，以避免错误的磷酸化-去磷酸化结果。此外，这种方法还需要目标蛋白质的纯化。因为目标蛋白质的末端磷酸化可以是非常低水平的，所以该方法有着非常差的效率。对于环境和健康特别严重的是大量使用放射活性，而高剂量的放射活性对于在高通量试验中施行该方法是必需的。用于测定激酶活性的其他可选的方法是基于磷酸化特异性抗体的方法，如ELISA和蛋白质印迹法。这种方法的缺点在于，制备抗体以及区分蛋白质的磷酸化和去磷酸化状态是困难的和成本非常高的。质谱仪(MALDI和ESI)在15年前已经用于测定经蛋白水解的蛋白质片段的一级结构。理论上，该方法的质量分辨率对于检测具有80Da的质量差异的磷酸化来说是足够的。然而，由于磷酸键的不稳定性和其在测量方法过程期间从蛋白质残基上的快速分解，所以MALDI-MS只可能有条件地用于磷酸化检测。磷酸化的质谱仪检测常常导致假阴性结果。此外，质谱仪的成本是极高的。从专利US 6,410,255中获知一种使得能够检测激酶活性的方法。该方法涉及一种为发荧光基团的传感器，该发荧光基团与一个激酶特异性部分和一个蛋白酶敏感性部分一起嵌入多肽中。蛋白质的修饰导致改变的蛋白酶裂解位点的可接近性和发荧光基团的分解。这借助于荧光显微镜进行检测。除了激酶之外，该方法还需要存在蛋白酶，它们之间的相互作用可能导致假象。缺点是荧光显微镜的高成本和需要对目标肽进行荧光标记。除了迄今说明的在检测激酶和磷酸酶活性时的缺点以外，到目前为止可以总结性地强调指出，在具有成千种组分的小样品体积中只有有限的快速检测这种活性的可能性。现在，还应当短时间地研究一下标题为“Bio-Chip”的专利DE 10051 252 A1。该DE专利描述了一种定性和/或定量检测分析物的方法，该分析物具有极化分子，特别是以分子形式溶解的生物分子。只要在测量室中存在有基质，具有大量的各为一个电容器的小测量室(＜1mm)的传感器有着一定的电容。如果将附加的材料以待检测的分子的形式置于基质上，那么该电容器的电容就会发生变化。该电容变化与分析物的浓度相关。当将生物活性物质引入测量室中时，会出现获取准确的测量数据的问题。此外，用于采用相应的测量电子学进行评测的、具有弹簧接点的细小机械系统有时成为测量误差的起因。快速测量的合理可能性是不可能的。DE 100 51 252 A1的这一解决方案是用于测量蛋白质结合的生物芯片(Bio-Chip)；而翻译后修饰活性的检测是不可能的。因此，本专利技术的任务是提供一种测定翻译后活性的自动化方法，该方法是高度灵敏的和不复杂的，以及可能能够用于所有激酶和磷酸酶活性。该方法应当不使用染料以及发荧光性或放射性物质。通过快速检测翻译后活性和成千种组分，将会对于药物的研究和开发、环境技术的基础研究以及分子医学诊断这些领域作出重要的贡献。用相应的装置系统来实施该方法。根据本专利技术这一任务可如下得以完成，即其中关于基本的想法可参阅权利要求1。本专利技术的其他布置可从权利要求2-9中获知。为了阐述本专利技术，进一步的说明是必需的。该技术解决方案使得能够在具有分析物或酶的液体样品中快速和有效地检测翻译后活性，这基于各自所使用的传感器的物理-化学特性的变化。液体样品是来自细胞的样品或具有测试物质的样品，向这些样品中添加了酶。为了检测翻译后修饰活性而开发出的传感器由合成的蛋白质片段或肽组成，这些蛋白质片段或肽含有对于蛋白质、激酶或其他酶的识别位点。与对于实施例所作的说明相联系可研究一下这种传感器的示意性图示。“识别位点”存在本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测翻译后修饰活性的方法，其特征在于，制备蛋白质片段或多肽作为传感器，所述蛋白质片段或多肽由含有一系列带电荷的残基的氨基酸残基（部分１和２）以及包含一个或多个修饰残基（Ｘ）的识别位点组成，并具有分子静电势分布，其中以偶极矩来测量静电势分布，向传感器添加酶，重新测量偶极矩，静电势的变化以及由此产生的偶极矩的变化就是翻译后修饰活性的证明。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：L瓦斯尔茨，
申请(专利权)人：比奥斯考拉有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]