快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法技术

本发明专利技术公开一种快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法。该方法的步骤如下：制备胶体金，将拉曼信号分子4,4'-联吡啶和ZEN单克隆抗体结合到胶体金表面，做成金纳米探针；经过硅烷化和醛基化将玻片活化，使其表面充满-CHO，将ZEN-BSA结合到活化了的玻片表面；制备一系列浓度梯度的样品液；将金纳米探针和样品液同时滴到含ZEN-BSA的玻片上；获得拉曼光谱图，绘制校正曲线；根据绘制的校正曲线，求待测样品中ZEN的含量。本发明专利技术所述的方法具有操作简单、灵敏度高、检测区间宽和特意性强的突出优点，人员不需要经过专业的培训就可以在最短的时间内实现检测，在食品安全、兴奋剂检测以及环境监控等领域具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种。该方法的步骤如下：制备胶体金，将拉曼信号分子4,4'-联吡啶和ZEN单克隆抗体结合到胶体金表面，做成金纳米探针；经过硅烷化和醛基化将玻片活化，使其表面充满-CHO，将ZEN-BSA结合到活化了的玻片表面；制备一系列浓度梯度的样品液；将金纳米探针和样品液同时滴到含ZEN-BSA的玻片上；获得拉曼光谱图，绘制校正曲线；根据绘制的校正曲线，求待测样品中ZEN的含量。本专利技术所述的方法具有操作简单、灵敏度高、检测区间宽和特意性强的突出优点，人员不需要经过专业的培训就可以在最短的时间内实现检测，在食品安全、兴奋剂检测以及环境监控等领域具有广泛的应用前景。【专利说明】快速定量检测玉米赤霉稀酮的方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种。
技术介绍
玉米赤霉烯酮毒素(Zearalenone),简称ZEN,又叫作F-2毒素,是一种酹的二轻基苯酸的内酯结构，分子式为c18h22 05。它首先从有赤霉病的玉米中分离得到，是镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物。玉米赤霉烯酮其产毒菌主要是镰刀菌属(Fusarium)的菌侏，如禾谷镰刀菌(F.graminearum)和三线镰刀菌(F.tricinctum)。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。其中玉米的阳性检出率为45 %，最高含毒量可达到2909mg/kg ；小麦的检出率为20 %，含毒量为0.364?11.05mg/kg ο玉米赤霉烯酮的耐热性较强，110°C下处理Ih才被完全破坏。玉米赤霉烯酮具有显著的植物生物学作用，如对植物生长的调控作用和在植物育种方面的作用，可以提高玉米幼苗的抗旱和抗寒的能力。玉米赤霉烯酮作为一种雌激素，具有雌激素的作用，但当其含量超标时，可引起急性和慢性中毒。在急性中毒的条件下，对神经系统、心脏、肾脏、肝和肺都会有一定的毒害作用，造成神经系统的亢奋，在脏器当中造成很多出血点，使动物突然死亡。在慢性中毒时，会导致母畜外生殖器肿大，充血，死胎，畸胎和延期流产，并且伴有木乃伊胎的现象，还会引起睾丸生殖细胞凋亡和睾丸萎缩。最近几年由于极端天气或者不恰当的储藏，农产品被玉米赤霉烯酮污染的现象普遍存在，加上贸易的全球化导致玉米赤霉烯酮在食物，饲料以及饲料原料中广泛存在。因此，进出口检疫和监督部门迫切需要一种快速高效的检测玉米赤霉烯酮的方法。表面增强拉曼散射(Surface-enhancedRaman scattering, SERS)标记技术是一种新颖的光谱标记方法，它利用金，银等贵金属的纳米粒子来增强吸附在其表面的标记分子的拉曼信号，并将其作为标记示踪信号。SERS标记技术有如下优点:①拉曼光谱具有高度的分子特征性，且谱峰窄，能够避免不同分子间的谱峰重叠；②拉曼散射几乎不受水的影响，能够广泛应用于水溶液中物质的检测SERS信号具有高强度、低背景的特点，很少受到光漂白的影响，为了获得较好的信号可在一定程度上延长检测时间SERS信号不易发生淬灭现象。SERS技术以其独特的优点在分析化学和生命科学领域日益受到重视。早前关于SERS的研究主要集中在蛋白质、DNA、微生物检测等方面。韩晓霞《基于表面增强拉曼散射的蛋白质检测方法研究》一文利用蛋白质和金属纳米粒子的相互作用形成SERS基底用于蛋白质检测；此外还结合SERS和ELISA的基本理论，设计了一种基于表面增强共振拉曼散射(Surface-enhanced resonant Raman spectroscopy, SERRS)利用突光分子代替酶促反应、以SERS检测取代吸光度的免疫吸附试验。郭红燕《SERS标记的金纳米探针用于免疫检测》一文中以对巯基苯甲酸为拉曼活性分子制备出SERS标记的金纳米棒探针和蛋白质抗体结合形成SERS标记抗体。通过SERS标记抗体、待测抗原和俘获抗体之间的免疫应答反应，将金纳米棒探针组装到固相基底上。这种SERS标记方法主要基于类似三明治结构的构建，基底上的俘获抗体和纳米粒子上的标记抗体通过与抗原的结合形式“俘获抗体-抗原-标记抗体”三明治夹心复合物，通过对标记分子SERS信号的检测进行免疫分析。蛋白质等大分子物质一般具有多个结合位点，能够很好的适用于传统的三明治结构。但是玉米赤霉烯酮是一种典型的小分子物质，由于其缺少多个结合位点，目前还没有专门的利用SERS对这类小分子物质，尤其是玉米赤霉烯酮的检测。基于SERS技术的优点，因此，发展一种利用SERS简单快速检测玉米赤霉烯酮的方法显得尤为重要。近几年，在霉菌毒素分析方面的进步促使一系列的分析方法应用于检测玉米赤霉烯酮。激光荧光分析-高效液相色谱法(LF-HPLC)，液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)，酶联免疫(ELISA);然而，这些方法样品前处理耗时，所用仪器庞大昂贵，还需要专业的操作人员，因此不利于现场实时检测。现在市售的酶联免疫试剂盒虽然选择性好，操作方便，但是价格昂贵，储存条件苛刻，假阳性表较高。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种。本专利技术的方法具有灵敏度高、特异性强、检测区间宽的特点；且本专利技术检测对象单一且针对性强，所需时间短，不需要经过培训的专业人员就可以使用本专利技术方法来检测，便于本专利技术方法的推广和运用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种，包括如下步骤:(I)将拉曼信号分子和ZEN单克隆抗体结合到胶体金表面，用牛血清白蛋白(BSA)封闭剩余活性位点，做成金纳米探针；(2)将玻片进行清洗,再用水虎鱼溶液浸泡,然后依次用硅烷和醛处理,使其硅烷化和醛基化，使表面充满醛基(-CH0)，和抗原ZEN-BSA偶联，最后用BSA进行封闭，得到固定抗原偶联物的基底；其中，玻片每经过一个处理都要用超纯水清洗和氮气吹干；(3)往空白饲料中添加ZEN标准溶液，混匀，用无水甲醇提取ZEN，经过分离和纯化，最终用PBS缓冲液溶解ZEN，制成一系列浓度梯度的样品液；(4)将步骤(I)的金纳米探针分别和步骤(3)制成的一系列浓度梯度的样品液同时滴到步骤(2)得到的固定抗原偶联物的基底上，则样品液中的ZEN和基底表面的ZEN-BSA竞争性的和胶体金表面的ZEN单克隆抗体结合；(5)根据ZEN浓度和拉曼信号强度的对应关系，绘制校正曲线；(6)取待测样品，用无水甲醇提取ZEN，经过分离和纯化，并用PBS缓冲液稀释，根据该待测样品获得的拉曼信号强度，通过步骤(5)的校正曲线快速得到该待测样品中的ZEN浓度。步骤(I)中所述的拉曼信号分子优选为4，4’ -联吡啶，该分子一边连接在胶体金表面，另一边和抗体相连，是双官能团标记分子；步骤(I)中所述的胶体金的平均粒径优选为30nm ；步骤(I)中所述的胶体金的制备过程包括如下步骤:在不断搅拌下将IOOmLlmM的HAuCl4溶液加热至沸腾，然后加入6mL38.8mM的柠檬酸三钠溶液，等到溶液变成深红色继续沸腾15?20min ;最后冷却至常温,得到30nm的胶体金溶液；步骤(1)中所述的ZEN单克隆抗体在结合到胶体金表面以前，拉曼信号分子首先标记到胶体金的表面；步骤(1)中所述的金纳米探针的制备过程包括如下步骤:往制备好的胶体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将拉曼信号分子和ZEN单克隆抗体结合到胶体金表面，用BSA封闭剩余活性位点，做成金纳米探针；(2)将玻片进行清洗，再用水虎鱼溶液浸泡，然后依次用硅烷和醛处理，使其硅烷化和醛基化，使表面充满醛基，和抗原ZEN‑BSA偶联，最后用BSA进行封闭，得到固定抗原偶联物的基底；其中，玻片每经过一个处理都要用超纯水清洗和氮气吹干；(3)往空白饲料中添加ZEN标准溶液，混匀，用无水甲醇提取ZEN，经过分离和纯化，最终用PBS缓冲液溶解ZEN，制成一系列浓度梯度的样品液；(4)将步骤(1)的金纳米探针分别和步骤(3)制成的一系列浓度梯度的样品液同时滴到步骤(2)得到的固定抗原偶联物的基底上，则样品液中的ZEN和基底表面的ZEN‑BSA竞争性的和胶体金表面的ZEN单克隆抗体结合；(5)根据ZEN浓度和拉曼信号强度的对应关系，绘制校正曲线；(6)取待测样品，用无水甲醇提取ZEN，经过分离和纯化，并用PBS缓冲液稀释，根据该待测样品获得的拉曼信号强度，通过步骤(5)的校正曲线快速得到该待测样品中的ZEN浓度。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡勇军，刘建芝，董宁，陶艳敏，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44