本发明专利技术为一种检测玉米赤霉烯酮的ＥＬＩＳＡ测试盒，其检测快速、灵敏、准确、操作简便、且对样品纯度要求不高，特异性强，适用于大批量样品的检测，为此本发明专利技术还提供了测试盒的制备及检测方法。其包括洗涤液、显色液Ａ、显色液Ｂ和终止液，其特征在于：其还包括包被板、玉米赤霉烯酮标准品、玉米赤霉烯酮单抗冻干品和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品；检测时取包被板，加入５０μｌ～１００μｌ的ＺＥＮ标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加５０μｌ～１００μｌ抗ＺＥＮ抗体，３５℃～４５℃孵育０．５小时～１小时，洗涤液洗３次～５次，加５０μｌ～１００μｌ辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）－羊抗鼠抗体，３５℃～４５℃孵育０．５小时～１小时，用洗涤液洗３次～５次，加５０μｌ～１００μｌ显色液Ａ和５０μｌ～１００μｌ显色液Ｂ，暗处静置１０分钟～２０分钟后加终止液，在４５０ｎｍ处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的ＺＥＮ含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体为玉米赤霉烯酮的酶联免疫分析用测试盒 及制备及检测方法。(二)
技术介绍
玉米赤霉烯酮(ZEN)可以由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、粉红色镰刀菌、 串珠镰刀菌、三线镰刀菌、茄病镰刀菌、木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌等多种镰刀 菌产生。在自然状态下这些镰刀菌主要侵染玉米，导致玉米的病毒和带毒。特 别是当玉米收获季节遇到阴雨天时更易遭到感染。除玉米外，小麦、大麦、燕 麦也可感染这些镰刀菌而带毒。ZEN是一种类雌性激素毒素，动物摄食后会产 生雌性激素亢进毒素性反应，玉米赤霉烯酮具有较强的生殖毒性和致畸作用， 可引起动物发生雌激素中毒症，主要症状有阴道和乳腺肿胀、子宫肿大、外翻、 导致动物不孕或流产，对家禽特别是猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业带来经 济损失；玉米赤霉烯酮可直接通过污染的谷类等作物进入人和动物体内，也可 通过被污染的肉、奶等动物性食品进入人体，其引起人中毒的症状主要表现为 无力、头痛、头晕、呕吐、腹泻和中枢神经系统的紊乱。我国修订的《粮食卫生标准》规定小麦、玉米中ZEN的限量为60pg/kg。 欧盟委员会规则856/2005号规定谷物食品和谷物中玉米赤霉烯酮的最大限量为 20 100pg/kg，于2006年7月1日生效。目前也有许多国家制定了玉米赤霉烯 酮的限量标准，奧地利规定小麦、裸麦、硬质小麦中不得超过60iig/kg，巴西、 法国、罗马尼亚、俄罗斯、乌拉圭等国也制定了相应的限量标准。因此，为了 保障人们的身体健康，必须要对食品中的ZEN进行监控。目前，ZEN的理化分 析技术主要有薄层色谱法、气液相色谱法、质谱和核磁共振等多种方法，由于 以上诸分析方法的样品前处理比较复杂、操作时需专门的技术人员、检测费用 昂贵，不利于推广应用。(三)
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒，其 检测快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯 度要求不高，特异性强，简化了样品预处理和纯化过程，特别适用于大批量样 品的检测，为此本专利技术还提供了测试盒的制备及检测方法。一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显色 液B和终止液，其特征在于其还包括包被板、玉米赤霉烯酮标准品、玉米赤 霉烯酮单抗冻干品和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒的制备其特征在于其包括以下 步骤，包被板的制备、玉米赤霉烯酮标准品的制备、玉米赤霉烯酮单抗冻干品 的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备。其进一步特征在于所述包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔 微孔板，用10 mmol / L 100mmol / L pH9~10 Na2C03-NaHC03的缓冲液作 为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(ZEN-OVA)稀释至0.1^ig/mL 1.0^ig/mL， 96或 48或24孔微孔板各孔加100^1， 2'C 8'C放置过夜，弃去包被液，洗涤2次 5 次，按加入含1% 5%牛血清白蛋白，pH 7 8的磷酸盐缓冲液，2'C 8。C封闭过 夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-2(TC -4(TC冷冻保存；所述玉米赤霉烯酮标准品从玉米赤霉烯酮纯品中稀释得到，稀释液为去离 子水，ZEN^农度为0.001 ng/mL 50 ng/mL;玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白(ZEN-BSA)偶联物的制备将ZEN溶解在 3mL 100mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加 入10ml 100ml蒸馏水，用氢氧化钠溶液调pH为8.5 9.5左右，再用二氯甲烷提 取3次 5次，每次10ml 20ml，弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2.5 3.5 左右，再用二氯甲烷提取3次 6次，每次10ml 20ml，收集二氯甲烷，过无水 硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN中间产物；取ZEN中间产物， 加入3 ml 50ml 二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5°C 12°C下搅拌反应30分钟 45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5ml 50ml 蒸馏水和5ml 50ml 二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8 9， 5°C~12°C下 搅拌反应5小时 6小时，然后，以蒸馏水进行透析，换液3次 5次，冷冻干 燥，偶联物-2(TC -4(rC保存；上述反应成分的比例为ZEN:羧甲基羟胺盐酸盐=(10 1000)mg : (10~2000)mg ， ZEN中间产物氯甲酸乙丁酯BSA = (10 1000)mg(10~1000)|Lil : (10曙3000)mg。玉米赤霉烯酮-卵清蛋白(ZEN-OVA)偶联物的制备将ZEN溶解在 3mL 100mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加 入10ml 100ml蒸馏水，用氢氧化钠溶液调pH为8.5~9.5左右，再用二氯甲烷提 取3次~5次，每次10ml 20ml，弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2.5 3.5 左右，再用二氯甲烷提取3次 6次，每次10ml 20ml，收集二氯甲烷，过无水 硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN中间产物；取ZEN中间产物， 加入3 ml 50ml 二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5°C 12°C下搅拌反应30分钟 45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5ml 50ml 蒸馏水和5ml 50ml二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8 9， 5°C~12°C下 搅拌反应5小时 6小时，然后，以蒸馏水进行透析，换液3次 5次，冷冻干 燥，偶联物-20。C -4(TC保存；上述反应成分的比例为ZEN:羧甲基羟胺盐酸 盐=(10~1000)mg : (10 2000)mg ， ZEN中间产物氯甲酸乙丁酯OVA = (10 1000)mg : (1(M000)pl : (10-3000)mg。所述抗玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体及其溶液的制备取ZEN-BSA偶 联物用生理盐水配成0.1iAg/)il 10 pg/W抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀， 充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏 佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为1(^ig/只 100^ig/只小鼠， 以后每隔2周~4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10jng/ 只 100iig/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小 鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:l比例混合，离心，去除 上清，在50 S 90 S内将0.1 ml 10 ml 50%聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞 中，充分混匀，使其融合，1分钟 3分钟后加入10ml 50mlDMEM培养液， 终止融合，水浴静止10分钟 30分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含5 30 %小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为^104 1><106饲养细胞 /0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5%~10%CO2， 35。C 45。C条件下培养，5天 10天后，每培养孔更换"3HT培养液，10天 20 天后，开始本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测玉米赤霉烯酮的ＥＬＩＳＡ测试盒，其包括洗涤液、显色液Ａ、显色液Ｂ和终止液，其特征在于：其还包括包被板、玉米赤霉烯酮标准品、玉米赤霉烯酮单抗冻干品和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐祖奇，张建中，毛丽华，
申请(专利权)人：无锡益达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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