一种冠心病和中风风险诊断试剂盒及其制作方法技术

本发明专利技术涉及医药生物技术领域，具体涉及一种冠心病和中风风险诊断试剂盒的制作方法。本试剂盒是一种用酶联免疫法定量分析人血浆或血清中Ｌｐ－ＰＬＡ↓［２］水平，用于预测冠心病及中风的发生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药生物
，具体涉及一种冠心病和中风风险诊断试剂 盒的制作方法。
技术介绍
来自卫生部统计资料全国36个巿全巿或部分巿区疾病监控结果表明，慢 性病是中国人群最主要的死因，占总死亡人数约70%,其中心脑血管为第一位, 恶心肿瘤为第二位，糖尿病成为危害人类健康的"第三大杀手"。心脑血管病作为危害人类健康的"第一杀手"，已波及全球，是许多富裕囯家 的主要灾难。由于冠心病的某些类型的诊断尚有一定困难，故通常以急性心肌 梗塞的发病率和死亡率来代表冠心病的发病和死亡，其中以死亡率更为常用。 目前，虽然治疗冠心病有介入技术、干细胞技术、药物洗脱支架等，但专家强 调，预防胜于治疗。靠发展现代化的冠心病急救和治疗技术是不够的，建立冠 心病人群的诊断防治技术和防治体系迫在眉睫。而中风是心脑血管病发病的主 要表现之一，我国是中风高发国家，每年新发200万。而最可怕的是即使应用 目前最先进、完善的治疗手段，仍有2/3病人致死或致残，现存活的中风患者 累积700万。另外，据卫生部有关资料统计，我国心脑血管病每年耗费约3000 亿元人民币。无疑随着人口的老化，心脑血管疾病将是一个巨大的社会和经济 负担。近30年来国内外许多研究都已证明，对心脑血管病最有效的治疗莫过于 早期诊断以预防为主、防治结合。最新的临床和流行病学的研究证实，50%冠心病患者的总胆固醇水平低于 人群正常值，因此一定有其它更重要的因素导致冠心病的发生。进一步的研究 表明血管炎症是引起冠心病的重要病因之一，因为动脉粥样硬化始于动脉内皮 细胞受损，引起内皮功能紊乱，进而引起一系列的免疫和炎症反应，如血管通 透性增加，细胞介素和生长因子增多，巨噬细胞聚焦于血管受损处，最终形成 硬化斑块。因此寻找新的特异性的与冠心病发病有关的炎症标记物将对冠心病 及中风的预测和防治有很重要的作用。Lipoprotein-associated phospholipase A2 (Lp-PLA2) 是血液中 一钩非依赖性的磷酯酶，大量科学研究和大型流行病学研究已证实其为一种全新、独立于已 知冠心病和中风危险因素的风险指标。Lp-PLA2主要源于巨噬细胞，在血浆中主要与低密度脂蛋白(LDL)结合，可水解氧化型LDL而产生两种炎症介质，如 溶血磷酯酰胆碱(Lyso-PC)和氧化型脂肪酸。Lyso-PC可促使内皮细胞功能紊 乱，巨噬细胞增多，促进T细胞和单核细胞聚集，细胞介素和CD40配体表达 增加，并对平滑肌细胞有很强的毒性。西苏格兰冠心病预防研究(West of Scotland Coronary Prevention Study, WOSCOPS)，在五年里随访了 6595例男性高 胆固醇的患者，发现血清中高水平的Lp-PLA2与冠心病的首次发作在统计学上 有显著地关联性。血清中Lp-PLA2高的患者冠心病发生的机率是正常者的两倍。 与传统的血清指标，如LDL、总胆固醇、白细胞数和纤维蛋白原相比，Lp-PLA2 是预测冠心病发作最好的指标。这一结论也被另一个著名的研究所证实。动脉 粥样硬化风险研究(Atherosclerosis Risk in Community, ARIC)在6-8年里，随访 了 12819例健康受试者和609例冠心病患者。此项研究得出与WOSCOPS相似 的结论，即Lp-PLA2是一特异的，独立的预测冠心病发生的重要指标。心脑血管疾病发病前就预防和控制住。而冠心病和中风风险诊断试剂盒利用特 异和高度灵敏免疫检测法(ELISA)来定量检测人血清或血浆中的Lp-PLA2的含 量，进而用于预测冠心病，缺血性心肌梗死及中风的危因。对于病情的预测、 预防具有重要的临床意义和社会经济效益。
技术实现思路
本专利技术是为了能快速、简便地检测血清或血浆中的Lp-PLA2的含量，而提 供一种操作简便、能准确预测冠心病及中风风险的诊断试剂盒及其制作方法和 使用。本试剂盒是一种用酶联免疫法定量分析人血浆或血清中Lp-PLA2水平， 与临床评估、病人患病风险率估计相结合，用于预测冠心病及与中风的发生。本专利技术所述的诊断试剂盒所需主要试剂和辅助用品如下 1.1试剂1.1.1包被缓冲液0.05M (pH9.6)碳酸盐缓冲液 l丄2洗涤缓冲液0.15M (pH7.4) PBS 1.1.3分析缓冲液(NH4)2S04,吐温-20的BSA l丄4终止液2MH2S04l丄5底物缓冲液pH5.0磷酸缓冲液1丄6TMB试剂(3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺)，微酸性缓冲液 1.1.7蛋白标准品浓度为1000ng/ml, 500 ng/ml， 250 ng/ml, 50 ng/ml, 0 ng/ml l丄8捕获抗体和酶标检测抗体 1.1.9正常人血清和阳性对照血清 1.2辅助品1.2.1 96孔酶标板1.2.2 ELISA检测仪(450nm)1.2.3 96孔板回旋震荡器 1.2.4微量加样器1.2.5 —次性无菌吸头1.2.6小烧杯、玻璃棒、试管、吸管、量简等 1.2.7 4。C冰箱，37。C孵育箱本专利技术所述一种冠心病和中风风险诊断试剂盒中纯化标准蛋白的制备方法 包括以下步骤(1 )经RT-PCR方法克隆人Lp-PLA2 cDNA于真核表达载体，测定cDNA序列；(2) 将测定的cDNA序列克隆到InsetDirect载体系统，此重组载体转染于 sf9昆虫细胞，在昆虫细胞中高效表达Lp-PLA2重组蛋白，经亲和层析、离子交 换层析、分子筛层析而高度纯化，作为标准蛋白。纯度高达98%以上；(3) 高度纯化的重组蛋白经由MS-SPEC鉴定； 捕获抗体和酶标检测抗体的制备方法包括以下步骤(1) 利用生物信息软件，选择具有不同抗原决定簇的高抗原特异性肽段， 再由BLAST程序与基因库中的序列相比，而最终选择出2-3个具有高免疫原性且独特的氨基酸序列的肽段；人工合成肽段并进行纯化；将测定的cDNA序列克隆到InsetDirect载体系统，此重组载体转染于sf9昆 虫细胞，在昆虫细胞中高效表达Lp-PLA2重组蛋白，经亲和层析、离子交换层 析、分子筛层析而高度纯化，纯度高达98%以上，作为标准蛋白；(2) 将纯化肽段交链于KLH,免疫小鼠；(3) 由纯化的标准蛋白(Lp-PLA2)筛选有免疫反应的小鼠；(4) 分离阳性小鼠脾细胞，并于肿瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞；(5) 进一步筛选，产生两株单抗细胞株；(6) 单抗细胞株经培养扩增，分泌单克隆抗体A和B,抗体经亲和层析而 进一步纯化；(7) 将纯化的单克隆抗体A作为捕获抗体，包被微孔板，制成固相抗体；(8) 将纯化的单克隆抗体B经辣根过氧化物酶标记而作为检测抗体。 免疫试剂盒的建立，包括以下步骤(1) 确定捕获抗体A(CaptureAntibody)和检测抗体B;(2) 辣根过氧化物酶标记检测抗体B;(3) 确定捕获抗体A和检测抗体B的最佳用量；(4) 建立并优化ELISA测试方法(Jump Program)。包括对试剂的组成成分 的确定，捕获和检测抗体用量的确定，及对特异性和灵敏度的测试，组间和组 内误差的测试，样品回收率的确定。 '该检测方法的检测灵敏度为1.3ng/ml,标准曲线为50ng/ml到1000ng/ml; 对于样品浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种冠心病和中风风险诊断试剂盒，其特征是包含有以下主要试剂和辅助用品：　１．１　试剂　１．１．１　包被缓冲液：０．０５Ｍ（ｐＨ９．６）碳酸盐缓冲液　１．１．２　洗涤缓冲液：０．１５Ｍ（ｐＨ７．４）ＰＢＳ　１．１．３　 分析缓冲液：（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］，吐温－２０的ＢＳＡ　１．１．４　终止液：２ＭＨ↓［２］ＳＯ↓［４］　１．１．５　底物缓冲液：ｐＨ５．０磷酸缓冲液　１．１．６　ＴＭＢ试剂：（３，３’，５，５’－四甲基联苯胺 ），微酸性缓冲液　１．１．７　蛋白标准品：浓度为１０００ｎｇ／ｍｌ，５００ｎｇ／ｍｌ，２５０ｎｇ／ｍｌ，５０ｎｇ／ｍｌ，０ｎｇ／ｍｌ　１．１．８　捕获抗体和酶标检测抗体　１．１．９　正常人血清和阳性对照血清　１．２　 辅助品：　１．２．１　９６孔酶标板　１．２．２　ＥＬＩＳＡ检测仪（４５０ｎｍ）　１．２．３　９６孔板回旋震荡器　１．２．４　微量加样器　１．２．５　一次性无菌吸头　１．２．６　小烧杯、玻璃棒、试管、吸管、 量筒等　１．２．７　４℃冰箱，３７℃孵育箱。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林东，柴希运，庞广礼，刘欣晏，仲立军，邵玉娟，李西河，李庆英，
申请(专利权)人：山东泰邦生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]