一种药物残留的检测方法技术

本发明专利技术涉及药物残留的检测方法，针对食品安全中的兽药残留检测种类繁多，检测通量需求高的特点，为解决当前药物残留检测中存在的价格昂贵、样本需求量大、操作费时、检测通量低等缺陷，利用药物分子的单克隆抗体和偶联抗原建立液相芯片竞争定量检测方法，建立了一种全新的多种药物残留检测方法，包括如下步骤：１）．小分子－蛋白偶联物与单克隆抗体的预处理；２）．液相芯片系统中微球的活化；３）．标准曲线的绘制；４）．待测样品信号值的测定；５）．根据标准曲线，计算待测样品中药物残留的含量。真正实现了高通量，可以在一个流程中同时对几种药物的残留情况进行检测；简化了操作程序，有效的降低了检测成本，缩短了检测时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药物残留的检测方法。
技术介绍
所谓兽药残留是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及/或其代谢物，以及与兽药有关的杂质的残留。兽药残留既包括原药也包括药物在动物体内的代谢产物。主要的残留兽药有抗生素类残留、激素类残留和驱虫药类残留。兽药通常是通过在预防和治疗动物疾病用药、在饲料添加剂中使用以及在食品保鲜中引入药物而带来对食品的污染。兽药残留对人体的危害1.人长期摄入含兽药残留的动物源性食品后，兽药残留不断在人体内蓄积，当积累到一定程度后，就会对人体产生毒性作用。如磺胺类药物可引起肾损害，特别是乙酰化磺胺在尿中溶解度低，析出结晶后对肾脏损害更大。2.经常食用一些含低剂量抗菌药物的食品还能使易感个体出现过敏反应，这些药物包括青霉素、四环素、磺胺类药物及某些氨基糖苷类抗生素等。这些药物具有抗原性，刺激机体内抗菌素体的形成，造成过敏反应，严重者可引起休克、喉头水肿、呼吸困难等严重症状。呋喃类引起人体的不良反应主要是胃肠反应和过敏反应，表现在以周围神经炎、药热、嗜酸性白细胞增多为特征的过敏反应。磺胺类药物的过敏反应表现为皮炎、白细胞减少、溶血性贫血和药热。青霉素药物引起的变态反应，轻者表现为接触性皮炎和皮肤反应，严重者表现为致死性过敏性休克。3.动物在经常反复接触某一种抗菌药物后，其体内的敏感菌株将受到选择性的抑制，细菌产生耐药性，产生大量耐药菌株。如果耐药菌株传播到人类身上，将会产生严重后果。当人体发生疾病时，就给临床上感染性疾病的治疗带来一定的困难，延误正常的治疗。已发现长期食用低剂量的抗生素能导致金黄色葡萄菌耐药菌株的出现，也能引起大肠杆菌耐药菌株的产生。至今为止，具有耐药性的微生物通过动物性食品转移到人体内时，对人体健康产生危害的问题尚未得到解决。4.在正常条件下，人体内有非常多的有益菌，有益菌群能抑制其他菌群的过度繁殖，某些菌群能合成B族维生素和维生素K以供机体使用。过多应用药物会使这种平衡发生紊乱，造成一些非致病菌死亡，使菌群的平衡失调，从而导致长期的腹泻或引起维生素缺乏等反应，造成对人体的危害。5.长期食用含低剂量激素动物性食品的后果也不可忽视。除以上影响以外，兽药残留还具有致畸、致癌、致突变作用。目前对于这些兽药残留的检测方法有高效液相色谱分析法(HPLC)和气象色谱/质谱联用分析法(GC/MS)或液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)。这些方法普遍存在着仪器昂贵，方法复杂，操作繁琐，试剂消耗量大的局限性。酶联免疫(ELISA)和放射免疫(RIA)技术以灵敏度高，特异性好，成本低，操作简单在兽药残留检测中广泛应用。但ELISA试剂盒，价格昂贵，仅能对单一的兽药检测，通量较低，且操作费时，不便于进行大批量分析。液相芯片系统是生物芯片领域已经发展成熟的一项技术。液相芯片系统包括液相芯片工作站和不同荧光编码的微球等。液相芯片工作站是一自动化程度极高的检测和分析仪器，荧光编码的微球目前共有100种，可检测100种与之相偶联的不同种类的目标分子。将这些微球悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相芯片系统，利用这个系统，可以对同一个样品中的多个不同的检测对象同时进行检测，这种检测技术称之为xMAP(flexible Multi～AnalyteProfiling)技术。在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的微球都带有一个独特的色彩编号。在微球的制造过程中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种红色分类荧光的比例不同，可以把微球分为100种。利用这100种微球，可以标记上100种不同的探针分子，同时对一个样本中的100种不同的目的分子进行检测。为了将不同特性的探针分子偶联到微球表面，在微球的表面进行了一系列的化学修饰，可与各种蛋白，肽，核酸等生物分子进行偶联固定。将这种标记好探针的微球与样品反应。探针可以与相应的目标分子特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子也与目的分子特异性的结合，本方法适用于定量和定性分析。检测的原理是使微球呈单列高速通过检测通道，并使用双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测。红色激光激发的是微球上的红色分类荧光，根据微球的不同荧光编码，可以将微球分类，从而将各个不同的分析反应区分开来。绿色激光激发的是报告荧光分子，目的是确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量。因此，通过红绿双色激光的同时检测，可以确定被结合的待测物的种类和数量。由于液相芯片系统检测是的某种荧光编码的群体信号，因此可信度更高。
技术实现思路
本专利技术针对食品安全中的兽药残留检测种类繁多，检测通量需求高的特点，为解决当前药物残留检测中存在的价格昂贵、样本需求量大、操作费时、检测通量低等缺陷，利用药物分子的单克隆抗体和偶联抗原建立液相芯片竞争定量检测方法，建立了一种全新的多种药物残留检测方法。本专利技术的具体技术方案如下本专利技术提供，包括如下步骤1)小分子-蛋白偶联物与单克隆抗体的预处理；2)液相芯片系统中微球的活化；3)标准曲线的绘制；4)待测样品信号值的测定；5)根据标准曲线，计算待测样品中药物残留的含量。步骤1)所述的小分子-蛋白偶联物与单克隆抗体的预处理是指先将小分子-蛋白偶联物和单克隆抗体分别进行纯化、除盐和除杂质，然后将抗体与D-生物素偶联；所述的小分子是指呋哺唑酮代谢物、喹乙醇和金霉素。步骤2)所述的液相芯片系统中的微球的活化是指用EDC活化微球上的羧基。步骤3)所述的制定标准曲线是指用步骤1)预处理好的抗原标准品，通过浓度梯度实验，测定在不同浓度抗原存在的情况下，液相芯片系统检测到的信号值，利用抗原浓度和液相芯片系统检测到的信号值绘制标准曲线。步骤4)所述的测定待测样品的信号值是指将待测样品进行预处理后，加至检测试剂中，利用液相芯片系统检测其信号值。作为优化方案，本专利技术所提供的药物残留的检测方法包括如下步骤1).小分子-蛋白偶联物和单克隆抗体的处理用缓冲液，除盐柱(购自SIGMA公司)将小分子-蛋白偶联物和单克隆抗体分别进行纯化、除盐和除杂质，再溶解于适量的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中；A.用30mL PBS 7.4的磷酸盐缓冲液平衡除盐柱；B.加入抗体，收集除盐柱洗脱下的液体，前3mL弃掉；C.用离心管依次收集第4，5，6，7四个1mL的液体；D.测定OD280，估算蛋白的量；2).单克隆抗体偶联生物素A.将D-BIONTIN(D-生物素)(SIGMA公司)加入第一步得到的抗体中，室温轻摇1～2小时；B.生物素标记单克隆抗体后，检测生物素偶联的效率，将过量的D-BIONTIN用透析法除去，冻干；3).液相芯片检测药物残留的试验A.用漩涡振荡器或者超声波悬浮微球(luminex公司)，大约20s；B.取50μL微球于1.5mL的离心管中，8000g离心1～2min，去上清液；C.加入100μL双蒸水，用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s，8000g离心1～2min；D.吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液(100mM Monobasic Sodium Phosphate，pH 6.2)(配方及试剂来源见附表)用漩涡振荡器或者超声波重悬浮微球，大约20s；E.加入10μL 50mg/mL Sulf本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术提供一种药物残留的检测方法，其特征在于包括如下步骤：１）小分子－蛋白偶联物与单克隆抗体的预处理；２）液相芯片系统中微球的活化；３）标准曲线的绘制；４）待测样品信号值的测定；５）根据标准曲线，计算 待测样品中药物残留的含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王蕾，陈书琨，琴智锋，汪朝晖，崔志君，林明祥，陈大军，
申请(专利权)人：北京盈九思科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]