一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法技术

本发明专利技术涉及药残检测技术领域，公开了一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法，包括：1）新霉素提取：将水产样品切块后混匀，充分匀浆；然后放置于离心管中，加入样品提取液进行提取，制得提取液；2）新霉素净化：提前将酶联免疫亲和柱放于室温下恢复至常温，用磷酸盐缓冲液平衡活化；将所得的提取液通过酶联免疫亲和柱，随后用淋洗液淋洗酶联免疫亲和柱，弃去洗出液，充分去除淋洗液，依次用有机试剂和无机酸洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液。本发明专利技术方法提取效率高，回收率好，特异性好，操作简单，成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药残检测
，尤其涉及一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法。
技术介绍
新霉素是氨基糖苷类抗生素的代表，是目前我国农业、畜牧业和水产业中常用的兽药之一，常用于防治鱼病，也添加到饲料中促进生长发育。但它可在动物组织内形成残留，通过食物链危害人类健康。因此，新霉素等抗生素在水产品中残留的危害日益受到全世界的重视。欧盟规定氨基糖苷类(链霉素、新霉素)不宜作饲料添加剂。欧盟、美国、日本和我国规定，动物性食品肌肉中新霉素的最大残留限量(MRLs)为0.5mg/kg；韩国规定动物性食品肌肉中的MRLs为0.25mg/kg。由于新霉素在组织中残留量较低，目前常用检测方法有微生物法、比色法、液相色谱法等。在检测新霉素含量时，需要将新霉素从组织中提取出来。传统的新霉素的提取与净化方法主要是固相萃取方式，虽然固相萃取具有较好的普遍适应性，但是由于水产品具有蛋白质基质比较复杂的问题，至今没有合适的固相萃取方式应用到水产品中新霉素的提取与净化方式研究。因此，目前亟需一种高效、稳定、操作简单、适用于将新霉素从水产品组织中提取与净化的方法。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法。本专利技术方法以CNBr—Actived Sepharose 4B为固相附着物，将抗体通过共价键连接到CNBr—Actived Sepharose 4B上制备酶联免疫亲和柱，并优化酶联免疫亲和柱的净化条件，以此为新霉素净化措施，较固相萃取柱具有更稳定，回收率高，可以多次重复使用的优势，可以显著地减少批间和批内差异，同时净化过程相对简单，且净化过程中不需要使用大型仪器，组装，净化方式简单易掌握。本专利技术的具体技术方案为：一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法，包括如下步骤：1)新霉素提取：将水产样品可食部分切块后混匀，充分匀浆；然后放置于离心管中，按每1g水产样品计，加入9-11mL样品提取液，振荡4-6min，组织分散0.5-1.5min，之后2-6℃下8000-12000r/min离心8-12min；其中，上清液转移至另一离心管中，用6mol/L NaOH调节pH至7.4-7.6；残渣中再加入9-11mL样品二次提取液，按第一次提取方法处理后，将两次所得的上清液合并，加入9-11mL正己烷静置8-12min，除去正己烷层，上清液中加入14-16mL稀释液，制得提取液。2)新霉素净化：提前将酶联免疫亲和柱放于室温下恢复至常温，用磷酸盐缓冲液平衡活化18-22min；将所得的提取液以0.9-1.1mL/min的流速通过酶联免疫亲和柱，随后用淋洗液淋洗酶联免疫亲和柱，弃去洗出液，充分去除淋洗液，依次用有机试剂和无机酸洗脱液以0.4-0.6mL/min的流速进行洗脱，分别收集洗脱液。酶联免疫亲和柱借助于抗原抗体的特异性结合，作为净化原理，稳定性好，回收率高，净化效果好，操作简单，可以多次重复使用。但是也存在技术缺陷：抗体的耐受性相比于化学净化材料要弱很多，水产品中新霉素的提取无法像传统方法那样采用较为强烈的无机酸处理。本专利技术对新霉素的提取以及酶联免疫亲和柱净化条件进行了改进，从而克服了上述技术缺陷。其中，步骤1)中，主要目的是从水产品中提取新霉素，生物样品具有基底复杂，含有大量蛋白、脂肪和其它干扰成分，不去除的因素，这些因素将严重影响目标物的测定结果。新霉素的提取过程中，低温离心，正己烷脱除等是去除提取液中脂肪的主要方式。而相较于脂肪样品中的蛋白质对后期酶联免疫亲和柱的净化影响很大，传统的脱除蛋白质的方法主要是各种有机酸及有机试剂，如三氯乙酸(TCA)，浓盐酸(HCl)，乙腈等脱除蛋白质，经过离心，调节pH后进行固相萃取柱净化。这样的方法对于强极性的新霉素回收率较低并且稳定性不足。同时样品提取过程中的有机酸等对酶联免疫亲和柱结合的抗体具有较大的危害性，因此本专利技术为适应酶联免疫亲和柱的前处理的需求，改进了新霉素的提取方法。步骤2)为净化方法，酶联免疫亲和柱具有很多适合作为新霉素净化的优点，如特异性高，可以重复使用，稳定性好等优点。本专利技术针对传统固相萃取方式的不足和抗原抗体结合方式自身的优点，利用酶联免疫亲和柱作为水产品中新霉素的净化方式；根据制备好的酶联免疫亲和柱，利用优化的提取方法从水产样品中提取新霉素，并通过酶联免疫亲和柱净化，建立一种水产品中新霉素的提取与净化方法。用去离子水淋洗，甲醇和柠檬酸依次洗脱的方式确立了净化方法。作为优选，所述样品提取液为浓度为2wt％的磺基水杨酸溶液。作为优选，所述磺基水杨酸溶液的配制方法如下：称取EDTA-Na2于烧杯中，按固液比1.5g/800mL加入去离子水，30-40℃超声处理18-22min；随后添加磺基水杨酸在搅拌状态下溶解，避光保存。作为优选，所述样品二次提取液为去离子水。作为优选，所述稀释液为去离子水。作为优选，所述淋洗液为去离子水，且淋洗液的用量为4-6mL。作为优选，所述样有机试剂为甲醇，所述无机酸洗脱液为柠檬酸洗脱液；且有机试剂的用量为1.5-2.5mL，无机酸洗脱液的用量为5-7mL。作为优选，柠檬酸洗脱液的配制方法为：准确称取柠檬酸21.01g溶于800mL去离子水里，用HCl溶液调节pH至1.5；随后定容到1000mL，常温超声18-22min备用。作为优选，所述酶联免疫亲和柱的制备方法如下：称取0.2gCNBr—Actived Sepharose 4B浸泡膨胀20-28h，然后用60mL的1mmol/L的HCl洗涤14-16min，随后用偶联缓冲液洗涤，得到凝胶；将该凝胶与含有5mL的偶联缓冲液与0.6mL纯化的抗体混合液混合，在室温下摇晃震荡2.5-3.5h，随后转移到柱中，至少用5倍体积的偶联缓冲液洗去未结合的抗体。其中，抗体是能与新霉素特异性反应的抗体。封盖：用封闭缓冲液静置浸泡中4℃过夜。洗涤：用不同pH的溶液至少洗涤柱子三个循环，每次至少5倍体积溶液，每个循环应包括含有不同pH的溶液中；固定抗体的凝胶柱用0.01mol/L PBS缓冲液平衡；然后转移到一个于顶部和底部放置挡板的SPE柱中，收集流出液，用紫外分光光度计测定，用偶联缓冲液冲洗该柱，直到流出液在280nm的紫外吸光度为0，然后用0.01mol/L PBS缓冲液冲洗，并在4℃下存储在0.01mol/L含有0.02％NaN3的PBS中待用。作为优选，所述偶联缓冲液为含有0.1mol/L碳酸氢钠和0.5mol/L氯化钠的溶液，其pH为8.3；所述封闭缓冲液为0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液；所述不同pH的溶液分别为pH为4.0且含有0.1mol/L醋酸盐和0.5mol/L NaCl的溶液、pH为8.0且含有0.1mol/L的Tris–HCl和0.5mol/L NaCl的溶液。与现有技术对比，本专利技术的有益效果是：1.本专利技术的提取方式较为温和，相比于传统的酸处理提取方式。磺基水杨酸在前处理过程中具有与三氯乙酸等传统提取试剂相似的效果，并且对于抗体的活性影响较小，提高了柱子的重复使用性。2.本方法制备的酶联免疫亲和柱具有专一性，针对新霉素作为抗原，利用抗原抗体的特异性结合作为净化原理，具有很好的专一性。3.由于酶联免疫亲和柱是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法，其特征在于包括如下步骤：1）新霉素提取：将水产样品可食部分切块后混匀，充分匀浆；然后放置于离心管中，按每1g水产样品计，加入9‑11mL样品提取液，振荡4‑6min，组织分散0.5‑1.5min，之后2‑6℃下8000‑12000r/min离心8‑12min；其中，上清液转移至另一离心管中，用6mol/L NaOH调节pH至7.4‑7.6；残渣中再加入9‑11mL样品二次提取液，按第一次提取方法处理后，将两次所得的上清液合并，加入9‑11mL正己烷静置8‑12min，除去正己烷层，上清液中加入14‑16mL稀释液，制得提取液；2）新霉素净化：提前将酶联免疫亲和柱放于室温下恢复至常温，用磷酸盐缓冲液平衡活化18‑22min；将所得的提取液以0.9‑1.1mL/min的流速通过酶联免疫亲和柱，随后用淋洗液淋洗酶联免疫亲和柱，弃去洗出液，充分去除淋洗液，依次用有机试剂和无机酸洗脱液以0.4‑0.6mL/min的流速进行洗脱，分别收集洗脱液。

【技术特征摘要】
1.一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法，其特征在于包括如下步骤：1）新霉素提取：将水产样品可食部分切块后混匀，充分匀浆；然后放置于离心管中，按每1g水产样品计，加入9-11mL样品提取液，振荡4-6min，组织分散0.5-1.5min，之后2-6℃下8000-12000r/min离心8-12min；其中，上清液转移至另一离心管中，用6mol/L NaOH调节pH至7.4-7.6；残渣中再加入9-11mL样品二次提取液，按第一次提取方法处理后，将两次所得的上清液合并，加入9-11mL正己烷静置8-12min，除去正己烷层，上清液中加入14-16mL稀释液，制得提取液；2）新霉素净化：提前将酶联免疫亲和柱放于室温下恢复至常温，用磷酸盐缓冲液平衡活化18-22min；将所得的提取液以0.9-1.1mL/min的流速通过酶联免疫亲和柱，随后用淋洗液淋洗酶联免疫亲和柱，弃去洗出液，充分去除淋洗液，依次用有机试剂和无机酸洗脱液以0.4-0.6mL/min的流速进行洗脱，分别收集洗脱液。2.如权利要求1所述的一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法，其特征在于，所述样品提取液为浓度为2wt%的磺基水杨酸溶液。3.如权利要求2所述的一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法，其特征在于，所述磺基水杨酸溶液的配制方法如下：称取EDTA-Na2于烧杯中，按固液比1.5g/800mL加入去离子水，30-40℃超声处理18-22min；随后添加磺基水杨酸在搅拌状态下溶解，避光保存。4.如权利要求1-3之一所述的一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法，其特征在于，所述样品二次提取液为去离子水。5.如权利要求1-3之一所述的一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法，其特征在于，所述稀释液为去离子水。6.如权利要求1-3之一所述的一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法，其特征在于，所述淋洗液为去离子水，且淋洗液的用量为4-6mL。7.如权利要求1-3之一所述的一种水产品中残留新霉素的提取与净化方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋建新，郑洪伟，曹立民，林洪，郑琦，崔梦琪，屈雪丽，曲欣，陈静，张鑫磊，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37