本发明专利技术为呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒。其检测快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、且对样品纯度要求不高，特异性强，特别适用于大批量样品的检测，为此本发明专利技术还提供了专用测试盒的制备及检测方法。其包括洗涤液、显色液Ａ、显色液Ｂ和终止液，其特征在于：其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、呕吐毒素（ＤＯＮ）标准品、呕吐毒素（ＤＯＮ）单克隆抗体冻干品以及酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。检测时，取包被板，加入５０μｌ～１００μｌ的ＤＯＮ标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加５０μｌ～１００μｌ抗ＤＯＮ抗体，３５℃～４５℃孵育０．５ｈ～１ｈ，洗涤液洗３次～５次，加５０μｌ～１００μｌ辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）－羊抗鼠抗体，３５℃～４５℃孵育０．５ｈ～１ｈ，用洗涤液洗３次～５次，加５０μｌ～１００μｌ显色液Ａ和５０μｌ～１００μｌ显色液Ｂ，暗处静置１０分钟～２０分钟后加终止液，在４５０ｎｍ处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的ＤＯＮ含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体为呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试 盒及制备及检测方法。(二)
技术介绍
呕吐毒素(Vomitoxin)，化学上称作脱氧腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol， DON),属于霉菌的单端孢菌素族，多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中， 其对谷物的污染率和污染水平居镰刀菌毒素之首，具有很高的细胞毒性及免疫 抑制性质，是由几种粉色镰刀霉真菌属产生的。呕吐毒素在小麦、玉米以及稻 米中的含量通常是mg/kg级。目前，呕吐毒素的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱法(GC), 薄层层析法(TLC)等，由于以上诸分析方法的样品前处理比较复杂、操作时需 专门的技术人员、检测费用昂贵，不利于推广应用。(三)
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒， 其检测快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品 纯度要求不高，特异性强，简化了样品预处理和纯化过程，特别适用于大批量 样品的检测，为此本专利技术还提供了专用测试盒的制备及检测方法。呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显 色液B和终止液，其特征在于其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、 呕吐毒素(DON)标准品、呕吐毒素(DON)单克隆抗体冻干品以及酶标记的 羊抗鼠抗体冻干品。呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于其包括以 下步骤，包被板的制作、呕吐毒素DON标准品的制作、呕吐毒素-牛血清白蛋 白DON-BSA偶联物的制备、呕吐毒素-卵清蛋白DON-OVA偶联物的制备、抗 呕吐毒素DON单克隆抗体及其溶液的制备、完全福氏佐剂的制备、不完全福氏佐剂的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备；洗涤液的制备；显色液A的 制备；显色液B的制备；终止液的制备。其进一步特征在于所述包被板包被呕吐毒素固相抗原，其采用96或48 或24孔微孔板，用10 mmol / L 1 OOmmol / L pH9~l0 Na2C03-NaHC03的缓 冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)稀释至0.1|ig/mL ~1.0|iig/m L， 96或48或24孔微孔板各孔加lOOpl， 2t: 8。C放置过夜，弃去包被液，洗 涤2次 5次，按加入含l。/。 5。/。牛血清白蛋白(溶于pH7 8的磷酸盐缓冲液)，2 'C 8"C封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-2(rC -4(TC冷冻保存。所述呕吐毒素(DON)标准品从呕吐毒素(DON)纯品中稀释得到，稀释 液为去离子水，DON浓度为0.001ng/mL~ 1000ng/mL。呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物的制备将DON溶解在吡啶中， 在反应瓶中加入1 一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜，产生7， 15 —氧一(丁 基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密封反应 瓶，混合物在沸水浴中搅拌90分钟 120分钟，产生3 —氧一半琥珀酰一 7， 15—氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇;将吡啶在室温吹干后，加入少量的水， 然后将残余物溶解于5mL乙酸乙酯中，超声波处理10分钟~30分钟后， 6000rpm 15000rpm下离心5分钟 30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶 解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓縮后备用；取浓縮物与N-羟 基琥珀酰亚胺(NHS)、 二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)中，室温振荡10min 60min，离心；将上清液缓慢滴加到牛血清白蛋 白(溶于O.Ol M 0.2MNaHCO3溶液中)，在2'C 8。C振荡2 hr 3 hr，然后，在 0.01 M -0.2M PBS (pH 7 8)溶液中透析，换透析液3次 8次；冷冻干燥， 偶联物-2(TC 4(TC保存；上述反应成分的比例为DON: 1 —丁基硼酸琥珀 酸酐=(l(MOOO)mg : (30 4000)mg : (10掘0)mg， 3 一氧一半琥珀酰一 7， 15 —氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓縮物NHS: DCC: BSA = (10~2000)mg : (3~1000)mg : (5-2000)mg: (10-6000)mg。呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)偶联物的制备将DON溶解在吡啶中， 在反应瓶中加入1 一丁基硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，产生7， 15 —氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90分钟 120分钟，产生3—氧一半琥珀酰一 7， 15 —氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的 水，然后将残余物溶解于乙酸乙酯中，超声波处理10分钟 30分钟后， 6000rpm 15000rpm下离心5分钟 30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋 溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓縮后备用；取浓縮物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 、 二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)中，室温振荡10分钟 60分钟，离心，将上清液缓慢滴加到卵清蛋白 (溶于O.Ol M 0.2MNaHCO3溶液中)，在2"C 8'C振荡2 hr 3 hr，然后，在 0.01 M 0.2M PBS pH 7 8溶液中透析，换透析液3次 8次；冷冻干燥， 偶联物-2(TC -4(TC保存；上述反应成分的比例为DON: l—丁基硼酸琥珀 酸酑二(10 1000)mg : (30 4000)mg : (10-2000)mg， 3—氧一半琥珀酰一 7， 15 —氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓縮物NHS: DCC: OVA = (10 2000)mg : (3 1000)mg : (5-2000)mg: (10掘0)mg。所述抗呕吐毒素(DON)单克隆抗体及其溶液的制备取呕吐毒素-牛血清 白蛋白(DON-BSA)偶联物用生理盐水配成0.1^ig/nl 10^ig/nl抗原溶液，与等 体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完 全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量 为10ng/只 100pg/只小鼠，以后每隔2周 4周加强免疫一次，加强免疫采用尾 静脉注射，免疫剂量10jxg/只 100 pg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后 取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/0以 10:1比例混合，离心，去除上清，在50S 90S内将0.1ml 10ml50X聚乙二 醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，1 min 3min后加入10ml 50mlDMEM培养液，终止融合，水浴静止10 min 30 min后离心，去除上清； 将融合细胞用含5%~30%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为 1 X 104~1 X 106饲养细胞/0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培 养板中，于5%~10%(:02， 35'C 45'C条件下培养，5天 10天后，每培养孔更换 2/3H本文档来自技高网...
【技术保护点】
呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒，其包括洗涤液、显色液Ａ、显色液Ｂ和终止液，其特征在于：其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、呕吐毒素（ＤＯＮ）标准品、呕吐毒素（ＤＯＮ）单克隆抗体冻干品以及酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张建中，徐祖奇，毛丽华，
申请(专利权)人：无锡益达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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