本发明专利技术公开了一种检测鸡γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）的双单克隆抗体夹心ＥＬＩＳＡ方法。采用抗ＣｈＩＦＮ－γ特异性单克隆抗体（ｍＡｂｓ）建立检测ＣｈＩＦＮ－γ特异性双单克隆抗体夹心ＥＬＩＳＡ方法。该方法以ｍＡｂ３Ｅ５作为捕获抗体，以生物素标记的ｍＡｂ ３Ｅ３作为检测抗体，建立检测ＣｈＩＦＮ－γ的双单抗夹心ＥＬＩＳＡ方法，可以灵敏的检测到微量的ＣｈＩＦＮ－γ（１２５－５００ｐｇ／ｍｌ）。该方法便捷、实用、灵敏、多效，可以用于检测生物样品中的ＣｈＩＦＮ－γ及重组的ＣｈＩＦＮ－γ，为检测和评价家禽的细胞免疫应答提供了灵敏的检测工具，将有利于研究ＣｈＩＦＮ－γ在家禽不同的免疫应答机制中的作用，有效弥补了现有ＣｈＩＦＮ－γ检测方法的不足。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学检测方法领域，具体涉及检测家禽细胞因子的双单克隆抗 体夹心ELISA方法。
技术介绍
Y-干扰素(IFN-Y，又称作免疫干扰素或II型干扰素)是细胞免疫应答的重 要媒介，在机体免疫应答调节方面具有重要功能，尤其对诱导及维持Thl细胞 免疫应答具有重要作用。Thl应答对抵抗胞内病原的感染非常重要，而IFN-y分 泌性T淋巴细胞的出现是Thl应答的标志。生物样品中IFN-Y的水平及IFN-y 分泌细胞的出现通常作为评价Thl免疫应答发生的标志。目前检测细胞因子的方法很多，主要有生物活性测定法、免疫学检测法，利 用核酸标记技术检测细胞因子等。但在复杂的生物样品中，对既定的细胞因子的 功能分析很多情况下并不能反映其实际的功能。如，在保护细胞抵抗病毒感染的 作用方面，I、 IIIFN均具有这种功能，尽管这两类IFN的结构并不是非常密切 相关的，且由不同的细胞所分泌，但如果仅从功能上进行分析，并不能准确反映 特定细胞因子的实际情况。而且，对特定的细胞因子而言，其活性半衰期很短， 导致对其功能的分析不再能进行，尽管在样品收集时，这些细胞因子是存在的，在蛋白质水平上仍能分析，但由于其活性的半衰期很短，导致功能上的分析不再 能进行。Northern blot， RNase protection及PCR等基因分析方法均高度敏感，且 与目的基因完全匹配，但其只能停留在基因转录水平上的分析，很多信息是难以 捕获的。因此，急需一种能够定性和定量检测生物样品中IFN-Y的检测方法。尤其是 针对胞内菌、寄生虫、病毒及其它病原引起的胞内感染，快速有效的细胞因子检 测工具及检测方法对这类疾病的检测和诊断非常有益。目前，由于缺乏有效的检 测工具及检测方法，对疾病条件下免疫状态的分析及评价很困难，为了改善这种 现状，人们进行了许多努力，如生产重组细胞因子，研制特异性抗细胞因子mAb 改进检测方法。随着单克隆抗体技术的发展，检测细胞因子的酶联免疫吸附捕获方法 (ELISA)得到了大力的发展。在其他的物种中，ELISA得到了很大的发展，并 且被证明是一种非常稳定、可信、简单、易行的细胞因子检测方法，可用于检测 经活化释放的细胞因子，因而，人们认为该方法是评价细胞免疫应答(CMI)的 很好的指示方法。而且，这种检测方法是多用途的，不但可以用于检测丝裂原或 许多病原再次刺激诱导的CMI，而且可用于检测免疫后激发的CMI。鸡在大量的家禽胞内感染疾病方面是一个重要的动物模型，到目前为止，选 择鸡作为家禽疾病的动物模型受到了许多限制，主要是因为缺乏适当的检测工具和检测系统。1995年Digby等成功克隆、表达出ChIFN-Y基因，对ChIFN-Y的研究 蓬勃开展，其功能研究工作也在进行当中。2000年，CheolH.等利用天然的或重 组的ChIFN-Y研制出抗ChIFN-Y mAb，并建立了直接ELISA方法检测艾美尔球虫 感染鸡的血清ChIFN-Y水平；随后，B. Lambrecht等利用基因枪免疫法制备出抗 CMFN-YmAb，并运用纯化的抗ChIFN-Y多抗作为捕获抗体，生物素标记的mAb 作为检测抗体，建立了检测CMFN-Y的双抗体夹心ELISA方法。本专利技术采用原核 表达的重组ChIFN-Y为免疫抗原及检测抗原，制备出抗ChIFN-YmAbs，运用纯化 的抗ChIFN-YmAb作为捕获抗体，生物素标记的mAb作为检测抗体，建立检测生 物样品中ChIFN-Y的双单抗夹心ELISA方法，该方法避免了运用多抗作为捕获抗 体，保证了包被抗体的稳定性和均一性，因为不同批次制备出的多抗可能存在很 大的差异，较难标准化，而mAb细胞株的优越性在于可以无限量地生产出具有均 一特性的mAb。ChIFN-Y抗原捕获ELISA可以在蛋白质水平上对ChIFN-Y进行评价，较生 物学方法更为简便、实用、灵敏，便于操作和大面积使用。该方法的建立为检测 鸡CMI提供灵敏的检测工具。而且，该方法将有利于研究ChIFN-Y在家禽的不 同的免疫应答机制中的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种简捷、实用、灵敏、高效的检测ChIFN-Y双单克 隆抗体夹心ELISA方法。本专利技术的技术方案是检观iJChIFN-Y的双单克隆抗体夹心ELISA方法，是 采用抗ChIFN-Y特异性mAb试剂，建立检湖iJChIFN-Y特异性双mAb夹心ELISA方法。该方法以mAb3E5作为捕获抗原，以生物素标记的mAb3E3作为检测抗体， 建立检领UChIFN-Y的双mAb夹心ELISA方法。该方法可以灵敏地检测到微量的 ChIFN-Y。上述方法具体的步骤是① 将捕捉抗体固定在固相支持物上，其中捕捉抗体为纯化的ChIFN-Y单克隆 抗体3E5;② 将生物样品与固相化的捕捉抗体保温，使ChIFN-Y与捕捉抗体结合；③ 使结合到固相化捕捉抗体上的ChlFN-Y与生物素标记的抗ChlFN-Y单克隆 抗体3E3接触，来检测CMFN-Y。所说的生物样品可分离自鸡血清、鸡血浆或细胞培养上清。上述方法中，mAb 3E5的包被浓度为85 u g/ml， mAb 3E3的工作浓度为0.67 U g/ml。该方法可以灵敏的检测到125-500 pg/ml的CWFN-y。应用本专利技术方法进行天然ChIFN-Y的检测无菌制备鸡脾脏淋巴细胞，用伴 刀豆蛋白(ConA， Sigma公司)刺激鸡脾脏淋巴细胞，取培养48小时的细胞培 养上清，获得天然ChIFN-Y，用建立的双单抗夹心ELISA方法测定天然的 ChIFN-Y,非常显著地检测到天然ChIFN- Y 。上述夹心ELISA方法中抗体的包被缓冲液为pH 7.2的PBS，检测抗体稀释 液为含0.05% Tween 20及1% BSA的PBST， avidin-HRP的稀释液为PBST(0.05% Tween-20、 1% BSA及10%小牛血清)，TMB显色，2MH2S04终止反应。本专利技术所建立的ChIFN-Y特异性捕获ELISA可以敏感的检测到经Con A刺 激的细胞培养上清中存在的天然ChIFN-Y。所建立的ELISA方法为评价Thl细 胞免疫应答提供了很好的检测工具。附图说明图1是鸡干扰素-Y双单抗夹心ELISA方法的敏感性实验(His-ChIFN-Y的浓度为1 000ng/ml，系列倍比稀释进行)单抗3E5作为捕获抗体，生物素标记的单抗3E3 作为检测抗体，可以检测到125-500 pg/ml重组鸡，干扰素(His-ChIFN-Y)图2双单抗夹心ELISA的特异性实验双单抗夹心ELISA检测系列倍比稀释的重组 鸡Y-干扰素(His-ChIFN-Y， 20ng/ml)及天然鸡？干扰素(Con A刺激鸡脾脏淋巴细胞所产 生)鸡？干扰素双单克隆抗体夹心ELISA的特异性实验(His-ChIFN-Y 20 ng/ml，系列倍比稀释进行；Con A刺激72 h的鸡脾脏淋巴细胞培养上清，倍比稀释进 行，X轴以Log2为单位)图3双单抗夹心ELISA检测不同数量鸡脾脏淋巴细胞(lxloe个细胞/ml、 2.5xl(^个细 胞/ml、 5xl(^个细胞/ml)经ConA (12ug/ml)刺激，不同培养时间段(24小时、48小时、 72小时、96小时)细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测生物样品中ＣｈＩＦＮ－γ的双单克隆抗体夹心ＥＬＩＳＡ方法，其包括以下步骤： ①将捕捉抗体固定在固相支持物上，其中捕捉抗体为纯化的ＣｈＩＦＮ－γ单克隆抗体３Ｅ５； ②将生物样品与固相化的捕捉抗体保温，使ＣｈＩＦＮ－γ与 捕捉抗体结合； ③使结合到固相化捕捉抗体上的ＣｈＩＦＮ－γ与生物素标记的抗ＣｈＩＦＮ－γ单克隆抗体３Ｅ３接触，来检测ＣｈＩＦＮ－γ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，戴华，郑佳玉，陈俊华，潘志明，陈祥，孙林，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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