食品中鲨鱼成分的实时荧光PCR检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及食品中鲨鱼成分的实时荧光PCR检测方法和试剂盒。本发明专利技术首次揭示一种可特异性鉴定鲨鱼成分的引物，所述引物针对含有鲨鱼成分的DNA可发生特异性扩增，而对没有鲨鱼成分的DNA不发生特异性扩增。因而，所述引物可良好地应用于鉴定鲨鱼成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和核酸检测
具体地，本专利技术涉及食品中鲨鱼成分的实时荧光PCR检测方法和试剂盒。
技术介绍
鲨鱼指软骨鱼纲板鳃亚纲鲨鱼总目的鱼类。鲨鱼不但在维持海洋生态平衡方面起着重要作用，而且是对人类十分有益的经济鱼类。鲨鱼鳍加工制成的鱼翅是价值较高的海产品之一，研究报道其富含胶原蛋白，有预防骨骼老化，防癌抗癌，滋补养颜、延年益寿等功效。鲨鱼软骨中提取的鲨鱼硫酸软骨素不仅能降低血脂，防治冠心病和心肌梗塞等心血管疾病，而且还常用作保护关节的膳食补充剂。鲨鱼肝中提炼的鲨鱼肝油富含多种维生素和多不饱和脂肪酸，是最理想的保健营养品。然而，一些不法商贩为追求巨大的经济利益，将不含真鱼翅成分的假鱼翅标成真鱼翅出售，将其他动物成分加工成的硫酸软骨素标注成鲨鱼硫酸软骨素混入市场，极大地扰乱了市场秩序，侵害了消费者的合法权益，影响了国际贸易。为保证进出口产品质量和进出口贸易的顺畅流通，必须建立鲨鱼类产品中鲨鱼源性成分的真实性鉴别方法。国外对鲨鱼类产品的研究主要集中在鱼翅的鲨鱼种属来源鉴定、鱼翅贸易引起的世界范围内鲨鱼种类和数量的变化、世界范围内鱼翅贸易的监控和管理方以及鲨鱼硫酸软骨素和鲨鱼肝油的生理保健功能和疗效等。国内对鲨鱼产品的研究主要有鱼翅营养成分的提取和定量分析、鱼翅的加工工艺和仿鱼翅的研制以及鲨鱼硫酸软骨素的提取优化和含量测定。目前，国内外对食品中鲨鱼源性成分真实性的鉴定方法研究都还很少，因此迫切需要开发有效的鉴定方法，以规范市场，保护消费者权益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供食品中鲨鱼成分的实时荧光PCR检测方法和试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供一种鉴定鲨鱼成分的方法，所述方法包括以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物进行PCR 扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鲨鱼成分。在一个优选例中，所述的选自(但不限于)狗鲨；加勒比斜锯牙鲨；鼠鲨；大青鲨；澳洲半沙条鲨；路氏双髻鲨；尖吻斜锯牙鲨；尖吻鲭鲨；舒氏星鲨。在另一优选例中，所述的PCR是STOR Green实时荧光PCR。在另一优选例中，所述的待测样品是食品。在另一优选例中，所述方法的检测灵敏度为10_4ng/y L DNA。在本专利技术的另一方面，提供一种引物，所述引物是引物对，其序列如SEQID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示。在本专利技术的另一方面，提供所述的引物的用途，用于从待测样品中鉴定鲨鱼成分。在本专利技术的另一方面，提供一种鉴定鲨鱼成分的试剂盒，其中包括所述的引物。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括含有鲨鱼成分的检测标准品(如鲨鱼阳性对照质粒)。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂DNA提取试剂(或试剂盒)，PCR 缓冲液，DNA 聚合酶，STOY Green Pre Mix。在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括说明鉴定鲨鱼成分的方法的使用说明书。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、鲨鱼DNA的STOR Green实时荧光PCR(SG-PCR)扩增曲线。图中曲线按箭头处从左到右依次为1 鲨鱼阳性对照质粒；2 狗鲨；3 加勒比斜锯牙鲨；4 鼠鲨；5 大青鲨；6 澳洲半沙条鲨；7 路氏双髻鲨；8 尖吻斜锯牙鲨；9 尖吻鲭鲨；10 舒氏星鲨。 图2、鲨鱼DNA的SG-PCR溶解曲线。箭头所指曲线为鲨鱼阳性对照质粒的PCR溶解曲线。该图纵坐标为荧光增量，式子-d(RFU)/dT。图3、48种非鲨鱼动植物的SG-PCR扩增结果。箭头所指曲线为鲨鱼阳性对照质粒的PCR扩增结果。图4、48种非鲨鱼动植物的SG-PCR溶解曲线。箭头所指曲线为鲨鱼阳性对照质粒的PCR溶解曲线。该图纵坐标为荧光增量，式子-d(RFU)/dT。图5、狗鲨DNA检测灵敏度扩增曲线。扩增曲线从左到右依次为1 IOng/ μ L ；2 Ing/ μ L ；3 KT1Iig/ μ L ；4 l(T2ng/ μ L ；5 :l(T3ng/y L ；6 :l(T4ng/y L。图6、鲨鱼肉粉(W/W)检测灵敏度扩增曲线。扩增曲线从左到右依次为1 狗鲨肉粉；2 狗鲨肉粉；3 :0. 狗鲨肉粉；4 :0. 01%狗鲨肉粉。图7、常见鲨鱼产品SG-PCR扩增曲线。扩增曲线从左到右依次是1 鲨鱼阳性对照质粒；2 泡发鱼翅1(购自上海人家饭店)；3:泡发鱼翅2 (由上海波特曼丽嘉酒店提供)；4:泡发鱼翅(购自上海馥园杨姐食品公司)；5 泡发鱼翅(由上海松江检验检疫局提供)；6 泡发鱼翅(购自上海小南国饭店)；7:鲨鱼肉(购自大连中天水产有限公司)；8:鲨鱼片(购自大连汇能海产品有限公司)；9 干鲨鱼鳍(由上海机场检验检疫局提供)；10 干鱼翅(由上海波特曼丽嘉酒店提供)；11 干鱼翅(由上海松江检验检疫局提供)；12:干鱼翅(购自上海铜川水产品市场)； 13 干鱼翅(购自上海家乐福超市)；14:冻干鱼翅(上海养中堂生物科技有限公司)；15: 鲨鱼源硫酸软骨素初级加工品(由上海祥源生物科技有限公司提供)；16:美国天然元鲨鱼软骨素胶囊(购自上海家乐福超市)；17:日本百傲鲨鲨鱼软骨素胶囊(购自上海易初莲花超市)。图8、常见鲨鱼产品SG-PCR溶解曲线。箭头所指曲线为鲨鱼阳性对照质粒的PCR溶解曲线。该图纵坐标为荧光增量，式子-d(RFU)/dT。具体实施例方式本专利技术人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种可特异性鉴定鲨鱼成分的引物，所述引物针对含有鲨鱼成分的DNA可发生特异性扩增，而对没有鲨鱼成分的DNA不发生特异性扩增。因而，所述引物可良好地应用于鉴定鲨鱼成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。本专利技术人通过对引物的筛选，获得一类可特异性鉴定鲨鱼成分的引物，其对于多种类的鲨鱼的DNA均发生特异性扩增，而对没有鲨鱼成分的DNA不发生特异性扩增。因此，本专利技术提供一种引物，所述的引物具SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。本专利技术的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。利用本专利技术的引物，只需进行常规的PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有鲨鱼成分，而且所需的样品量很少。基于本专利技术所提供的适用于鉴定鲨鱼成分的特异性引物，本专利技术还提供了一种鉴定鲨鱼成分的方法，所述方法包括以待测样品的DNA为模板，以SEQID NO :1和SEQ ID NO 2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鲨鱼成分聚合酶链反应(PC 技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本专利技术的方法可采用常规的PCR技术进行。作为本专利技术的优选方式，利用所述引物，采用STOR Green实时荧光PCR方法来进行鲨鱼成分的鉴定。STOR Green(SG)是一种荧光染料，能结合到DNA双螺旋的小沟。处于溶解状态的未结合染料显示低的荧光强度，一旦结合到双链DNA之后荧光信号增强。SG的这种特性被利用在实时PCR扩增中，由于在扩增反应中DNA增加，染料结合到扩增产物上， 荧光信号增强，通过荧光信号相对背景水平的增加进行分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种鉴定鲨鱼成分的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样品的ＤＮＡ为模板，以ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示的引物进行ＰＣＲ扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鲨鱼成分。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张舒亚，郭云霞，李富威，谌鸿超，陈颖，黄文胜，
申请(专利权)人：上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：31