转基因玉米MIR604双重数字PCR荧光定量检测方法技术

本发明专利技术提供一种针对转基因玉米MIR604的双重数字PCR荧光定量检测方法，本方法可以直接对待检测样品的基因组中的转基因玉米MIR604进行定量检测，从而省去了常规PCR方法定量检测中标准曲线绘制步骤以及现有数字PCR检测中的样品前处理步骤，另外，在本方法中，由于转基因成分是通过外源基因拷贝数与内参基因拷贝数的比例计算得到的，因此在同一个反应体系进行双重检测可以提高转基因成分定量检测的稳定性。利用本方法可实现对转基因玉米MIR604的绝对定量检测，定量检测限可达到0.5％，灵敏度可达到0.1％，能够满足所有转基因成分实际检测的需要。此外，本方法操作简单，灵活性强，是一种转基因绝对定量检测的有效方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学检测
，具体地说，涉及转基因玉米MIR604双重数 字PCR荧光定量检测方法。
技术介绍
自1996年首例转基因番茄在美国成功商业化以来，对于转基因作物的研究近 二十年来取得了迅速的发展。根据ISAAA统计数据，截至2014年，全球转基因作物的种植 面积已经达到1. 8亿公顷，比1996年种植面积提高了近100倍，占全球作物种植总面积的 3. 4%。转基因作物的快速发展不仅为现代农业提供了更加便利的育种方式，也由于其未知 的安全隐患引起了各个国家和地区的广泛关注。为此，各国家和地区纷纷建立起转基因成 分的标识制度。在全球各国家和地区制定的转基因成分标识制度中，定量标识制度占据较 大比重，其中以欧盟和日韩最具代表性。我国在转基因成分标识方面主要采取定性标识制 度，由于定性标识制度与定量标识制度在检测技术等方面存在不同，使我国在作物进出口 方面容易受到国际标准的制约。为此，我国需要大力发展转基因成分定量检测技术并建立 相关定量标识制度。 数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的绝对定量PCR检测方法，是一项检测和定 量核酸的新技术，其基本原理是通过将微量样品进行大倍数稀释和分液，直至每个样品中 所含有的待测分子数不超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，有PCR扩增 荧光信号记为1，无荧光信号记为0,有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分 子，针对反应结果采用泊松分布（Poissondistribution)公式，便可计算出样本的最初 拷贝数或浓度。该技术不依赖于扩增曲线的循环阈值，也无需看家基因和标准曲线，即可 实现DNA绝对定量。该技术在基因拷贝数变化分析（copynumbervariation,CNV)(Qin etal.，2008)、遗传突变检测（Yungetal.，2009)、基因分型（Loetal.，2007)、基因定 量（Warrenetal.，2010)、单细胞基因表达（Guoetal.，2010)等方面的研究取得了突破 性的发展，在临床方面为癌症、肿瘤等疾病检测提供了新的诊断方法。在转基因检测方面， Corbisier等（2010)利用数字PCR分析了玉米种子DNA中外源基因和内参基因的拷贝数之 比，该结果与利用普通荧光定量PCR技术以质粒DNA为标准物质检测的结果相同，证明了数 字PCR的可靠性。Burns等（2010)评估了数字PCR在转基因检测中检测限（L0D)和定量限 (L0Q)，探索了数字PCR在转基因检测方面的可行性和反应条件，表明数字PCR能够对起始 模板拷贝数进行绝对定量。然而利用数字PCR对转基因检测的研究还处于起步阶段。现有 数字PCR检测方法都需要经过样品前处理过程，在实际检测中，前处理过程往往会导致实 验结果产生偏差。因此现有的数字PCR检测方法不适合直接作为转基因成分的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种不需要进行样品前处理步骤的，针对转基因玉米MIR604 的双重数字PCR荧光定量检测方法，可实现对转基因玉米品系MIR604的绝对定量。 为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供用于转基因玉米MIR604双重数字PCR荧光 定量检测的引物和探针组合，所述引物和探针组合为：外源基因正向引物：5' -GCGCACGCAAITCAACAG-3'外源基因反向引物：5' -GGTCATAACGTGACTCCCTTAAITCT-3'外源基因探针：5'-FAM-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-BHQ1-3'内参基因hmga正向引物：5' -TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'内参基因hmga反向引物：5' -GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3' 内参基因hmga探针：5' -VIC-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-BHQ1-3'。 本专利技术还提供含有所述引物和探针组合的转基因玉米MIR604数字PCR双重荧光 定量检测试剂盒。 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳 性模板等中的至少一种。 本专利技术进一步提供转基因玉米MIR604双重数字PCR荧光定量检测方法，所述方法 包括以下步骤： 1)提取待测样品的基因组DNA; 2)以提取的基因组DNA为模板，利用所述的引物和探针组合，进行数字PCR扩增反 应；3)检测PCR扩增产物。 其中，数字PCR扩增反应的反应体系以4yl计为：基因组DNAlyl，225nM外 源基因正、反向引物各0. 04yl，225nM内参基因正、反向引物各0. 04yl，50nM外源基因 探针 0? 02yl，50nM内参基因探针 0? 02yl，2XMasterMix(购自Fluidigm公司）2y1， 20XLoadingReagent(购自Fluidigm公司）0? 4y1，ddH20 补足至 4y1 〇 数字PCR扩增反应的程序为：50°C热激活300s;95°C预变性300s;95°C变性15s， 60°C退火及延伸60s，共50个循环；在60°C下采集荧光信号。 前述的方法，步骤3)中检测PCR扩增产物具体如下：在数字PCR扩增反应结束后， 记录各反应孔中外源基因和内参基因的荧光信号值，通过泊松分布公式计算各反应孔中外 源基因与内参基因的拷贝数，通过两者的拷贝数之比得到转基因成分的绝对浓度。 本专利技术是在PCR芯片中进行数字PCR扩增反应。将每个加样孔作为一个整体，加入 转基因作物数字PCR扩增体系进行实时荧光扩增，通过监测每个反应孔中的荧光信号值， 获得所有反应孔中的总体扩增曲线和热点图。 检测结果的判定按照以下方式进行： 1、在利用数字PCR进行扩增的过程中，阳性孔的判定方法为：出现明显区别于阴 性反应孔（阴性反应孔中模板为1y1ddH20)的扩增信号，将该反应孔记为阳性扩增孔；阳 性样品的判定方法为：在相同样品的三个平行组内，至少出现一组有阳性扩增孔，则表明检 测样品基因组中含有转基因作物成分； 2、在数字PCR扩增结束后，记录每个扩增孔中外源基因和内参基因的亮点数，通 过泊松分布公式计算每个孔中外源基因与内参基因的拷贝数，通过两者的拷贝数之比得到 转基因成分的绝对浓度； 3、每个样品设置三个平行组，通过统计分析得到三个平行组内转基因成分浓度的 相对标准偏差（1?0)，1?0<25%表明定量结果有意义； 4、当待测样品反应孔中为阴性结果时，表明未检测到转基因作物成分；当待测样 品反应管中为阳性结果时，表明待测样品中含有转基因作物成分。 本专利技术方法可以直接对待检测样品的基因组中的转基因玉米MIR604进行定量检 测，从而省去了现有的数字PCR方法中的样品前处理步骤，使得检测过程简便易行，避免了 前处理步骤对检测结果准确性的不良影响。另外，在本专利技术方法中，由于转基因成分是通过 外源基因拷贝数与内参基因拷贝数的比例计算得到的，因此在同一个反应体系进行双重检 测可以提尚转基因成分定量检测的稳定性。 利用本专利技术提供的双重数字PCR荧光定量检测方法和检测试剂盒可以实现对转 基因玉米MIR604的绝对定量检测，本方法定量检测限可达到0. 5%，灵敏本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于转基因玉米MIR604双重数字PCR荧光定量检测的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合为：外源基因正向引物：5'‑GCGCACGCAATTCAACAG‑3'外源基因反向引物：5'‑GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT‑3'外源基因探针：5'‑FAM‑AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG‑BHQ1‑3'内参基因hmga正向引物：5'‑TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA‑3'内参基因hmga反向引物：5'‑GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT‑3'内参基因hmga探针：5'‑VIC‑CAATCCACACAAACGCACGCGTA‑BHQ1‑3'。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：付伟，朱鹏宇，杜智欣，王晨光，魏霜，张亮亮，彭萱子，朱水芳，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11