本发明专利技术公开了一种让外源DNA穿越卷枝毛霉未萌发孢子细胞壁和细胞膜的方法，包括卷枝毛霉培养和孢子收集、卷枝毛霉孢子预处理以及使用HDEN法电击卷枝毛霉孢子三个步骤，得到导入待转化质粒的卷枝毛霉孢子。本发明专利技术用未萌发的孢子来作为导入外源分子的起始材料，并且应用HDEN电转化技术将外源DNA导入卷枝毛霉休眠孢子，可以省去做孢子萌发这一复杂的步骤，省去传统方法中制备原生质体或农杆菌转化的步骤等，并且转化率高，每个转化反应体系，至少可以达到不少于6000个阳性转化子的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及让外源DNA穿越卷枝毛霉未萌发孢子细胞壁和细胞膜的方法。
技术介绍
卷枝毛霉是一种工业发酵菌种，可以生产降粘酶等各种重要的工业产品。但是对其转化外源DNA非常困难，制约了其基因工程改造。基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建DNA分子，然后导入细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品（比如将某个具有重要经济价值的酶基因，导入到卷枝毛霉细胞内，做酶蛋白高表达，生产该酶）。这一领域中，很重要的一个环节，就是把外来的DNA，导入到细胞内部。针对不同物种和不同状态的细胞，需要不同的导入方法，才可以让外来的DNA跨过细胞壁和细胞膜，运送到细胞内部。目前用于丝状真菌领域（包括卷枝毛霉）的主要DNA转化方法包括：1．原生质体介导转化（protoplast-mediated transformation）：该方法使用各种酶水解真菌菌丝体的细胞壁，暴露出细胞膜，在一定的化学条件下，细胞膜可以吸收外源DNA。但是由于真菌细胞壁的结构和成分复杂，而且不同物种、甚至同一物种的不同亚种的细胞壁结构和成分都不一样，因此，无法统一原生质体制备的方法，而且，很多真菌，尤其是卷枝毛霉，原生质体制备非常困难，步骤极其繁琐，而且需要特殊的、昂贵的细胞壁水解酶。2.根瘤农杆菌介导转化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）：根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性菌，能够侵染植物愈伤组织和丝状真菌，将能在细胞中稳定遗传的环状质粒Ti-DNA插入到宿主的基因组中。但是该方法步骤很繁琐，耗时长，而且农杆菌对宿主有选择性，并非所有真菌都适合用这种方法。此外，外源DNA插入宿主基因组的位置是随机的，无法预判。外源DNA只能插入宿主基因组，不能够游离地存活在宿主的细胞质中。3．基因枪转化法（Biolistic Transformation）：该方法将DNA吸附在特种金属颗粒的表面，用火药爆炸或者高压气体加速，将吸附了DNA的金属颗粒直接送入完整的组织或者细胞。这种方法需要非常昂贵的特殊实验设备，而且所用的金属颗粒耗材常常需要使用黄金材料。此外，该方法转化效率并不高，而且宿主细胞在金属颗粒轰击下死亡率高，再生较困难，因此其使用范围受到限制。4，电击转化（Electroporation）：这是一种用电脉冲短暂作用于接触了外源DNA的细胞，使外源DNA进入细胞，从而使细胞遗传特性发生改变的方法。与农杆菌法需要农杆菌作为介质、基因枪法需要金属颗粒作为介质不同，这种方法不需要介质来携带外源DNA。传统的电击法，包括指数衰减波电击和方波电击。指数衰减波电击的能量特别大，对细胞的损伤也很大，而微生物细胞由于结构简单，有细胞壁，细胞抗逆性强，生命力强，而且很多微生物细胞的外壳坚硬，能够耐受大能量电击，因此指数衰减波电击一般仅用于微生物细胞。而哺乳动物细胞（比如人类细胞系），相对微生物而言，比较脆弱，容易死亡，因此，方波电击常用于哺乳动物细胞。此外，方波电击还广泛应用于小动物（如小鼠）的活体电转化。2013年面世的HDEN电转化技术（high-density distributed electrode network），是一种专门针对哺乳动物细胞的特性，而开发的电转化技术，其开发目的是为了提高向哺乳动物细胞内传送外源DNA和药物的效率。该技术包含3大部分内容，一是施加于细胞样品的电波形式，二是细胞样品在电击时的溶液环境，三是细胞样品的培养方法和电击前预处理方法。由于该技术是专门针对哺乳动物细胞开发的，因此，上述3大部分内容，都是针对哺乳动物细胞的特性而设计。在本领域内众所周知，微生物细胞的特性和培养方法，与哺乳动物细胞相比，千差万别。哺乳动物细胞和微生物细胞的结构不同，哺乳动物细胞没有细胞壁，微生物细胞（比如绝大部分真菌、包括卷枝毛霉）有细胞壁。哺乳动物细胞的细胞膜和微生物的细胞膜也不一样。因此，任何应用于哺乳动物细胞的技术，都很难直接应用于微生物细胞。现有文献报道了HDEN技术在HEK-293A，Hela，Neuro-2A，MCF-7，C2C12，3T3-L1，CHO，MDCK，HL-60，HUVEC，A375，U251等哺乳动物细胞中的应用。目前尚未有该技术在哺乳动物细胞以外的物种中应用的案例报道。因此，HDEN电转化技术能不能应用于哺乳动物细胞以外的物种，也是一个未知数。丝状真菌（包括卷枝毛霉）是一类真核微生物，很多类型的真菌的基因组是多倍体。对生命个体做基因工程改造时，最困难的就是面对多倍体现象。因为对多倍体的改造，常常效率低下（比如基因打靶可能只命中一条染色体，而脱靶另外一条或几条同源染色体），而且多倍体在分裂繁殖时，同源染色体分离，也很难把改造位点遗传给所有子代。这在本领域内众所周知。真菌孢子是真菌的主要繁殖器官，孢子呈休眠状态且可以生存很长时间。孢子在适宜的外界条件下，能够苏醒并萌发，形成菌丝而进行分裂繁殖。最为重要的是，很多类型真菌的孢子，是天然的单倍体，直接对单倍体孢子进行基因工程改造，效率远远高于操作多倍体。但是，由于孢子一般处于休眠状态，其细胞壁非常厚实，休眠孢子的细胞壁、细胞膜的状态，与萌发孢子、与菌丝体是不同的。且休眠孢子细胞内的生命活动也处于最不旺盛的状态，因此，本领域公知，休眠孢子的细胞通透性不如萌发孢子和菌丝，休眠孢子几乎不与外界交流物质，闭关锁国，一般处于睡眠状态。而萌发孢子或菌丝体，需要从外界吸收各种营养分子供给生命活动，因此细胞壁和细胞膜的通透性大于休眠孢子。所以，非常难以将外源DNA分子直接导入到睡眠孢子的内部。现有的几大成熟技术中：原生质体转化法，作为宿主细胞的原生质体的来源，一般是真菌的菌丝体（多倍体）。农杆菌介导转化法，在农杆菌介导下，把农杆菌和真菌孢子在固体培养基表面共培养数天，可以把外源DNA导入真菌细胞。但是这种做法并非是直接对孢子进行转化，因为在共培养过程中，真菌孢子会萌发，然后农杆菌侵袭萌发孢子，才能导入外源DNA。而且农杆菌法，需要农杆菌作为介导的介质，需要先做一个农杆菌转化，才能做后续的真菌转化，因此操作非常复杂和繁琐，且周期长。传统的电击转化法（使用的是指数衰减波电击），宿主细胞采用的是萌发的真菌孢子。例如Ozeki等创立的针对真菌孢子的电击方法，必须要让孢子萌发后，才能电击转化（该方法披露了让孢子萌发的具体实验步骤和细节）。该方法是行业内首创的经典技术，目前为止无显著改进，一直被本领域人员沿用至今。本申请专利技术人也尝试过用该方法转化未萌发孢子，没有成功，目前，也没有任何成功的文献报道。Ozeki等创立的方法见文献1：OZEKI K, KYOYA F, HIZUME K, KANDA A, HAMACHI M, NUNOKAWA Y. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1994, 58(12): 2224-2227.目前，本文档来自技高网...
【技术保护点】
让外源DNA穿越卷枝毛霉未萌发孢子细胞壁和细胞膜的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1）卷枝毛霉培养和孢子收集在固体琼脂培养基表面接种卷枝毛霉，培养至培养基表面长满卷枝毛霉孢子，洗下培养基表面的卷枝毛霉孢子，吸出孢子悬液并过滤去除菌丝，收集含有孢子的滤液，将滤液离心，收集沉淀的休眠孢子；2）卷枝毛霉孢子预处理用电击缓冲液重悬孢子，离心并收集孢子沉淀，重复上述重悬和离心步骤3‑4次后，将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中，得到孢子浓度为104‑1011个/ml的卷枝毛霉孢子悬液；所述电击缓冲液由终浓度为0.01‑100mmol/L的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为0.5‑5000mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为3.0‑9.5；3）使用HDEN法电击卷枝毛霉孢子在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的卷枝毛霉孢子悬液以及待转化质粒，混匀，得到孢子与质粒混合物，将细胞培养板置于冰上冰浴10‑15min，然后采用Etta Biotech X‑Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与质粒混合物内部，通电，使得孢子与质粒混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10‑15min，然后将孢子和质粒混合物吸出，得到导入外源DNA的休眠的卷枝毛霉孢子；所述卷枝毛霉悬液与待转化质粒的比例为：6‑600000μl的卷枝毛霉孢子悬液：0.1‑10000μg的待转化质粒；所述电击参数如下：电压1‑6000V，脉宽2‑2000000ms，重复1‑100次，每次间隔5‑50000ms。...
【技术特征摘要】
1.让外源DNA穿越卷枝毛霉未萌发孢子细胞壁和细胞膜的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1）卷枝毛霉培养和孢子收集在固体琼脂培养基表面接种卷枝毛霉，培养至培养基表面长满卷枝毛霉孢子，洗下培养基表面的卷枝毛霉孢子，吸出孢子悬液并过滤去除菌丝，收集含有孢子的滤液，将滤液离心，收集沉淀的休眠孢子；2）卷枝毛霉孢子预处理用电击缓冲液重悬孢子，离心并收集孢子沉淀，重复上述重悬和离心步骤3-4次后，将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中，得到孢子浓度为104-1011个/ml的卷枝毛霉孢子悬液；所述电击缓冲液由终浓度为0.01-100mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为0.5-5000mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为3.0-9.5；3）使用HDEN法电击卷枝毛霉孢子在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的卷枝毛霉孢子悬液以及待转化质粒，混匀，得到孢子与质粒混合物，将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与质粒混合物内部，通电，使得孢子与质粒混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min，然后将孢子和质粒混合物吸出，得到导入外源DNA的休眠的卷枝毛霉孢子；所述卷枝毛霉悬液与待转化质粒的比例为：6-600000μl的卷枝毛霉孢子悬液：0.1-10000μg的待转化质粒；所述电击参数如下：电压1-6000V，脉宽2-2000000ms，重复1-100次，每次间隔5-50000ms。2.根据权利要求1所述的让外源DNA穿越卷枝毛霉未萌发孢子细胞壁和细胞膜的方法，其特征在于：所述步骤1）的培养基为PDA培养基、YPD培养基或察氏培养基。3.根据权利要求1所述的让外源DNA穿越卷枝毛霉未萌发孢子细胞壁和细胞膜的方法，其特征在于：所述步骤1，）卷枝毛霉...
【专利技术属性】
技术研发人员：林峻，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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