本发明专利技术提供了一种快速便捷评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的培养基组合，包括第一液体培养基和第二液体培养基，利用第一液体培养基和第二液体培养基的差异性来筛选生物被膜促进物质，同时还可以评估不同浓度的待测物质促进生物被膜形成能力的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及芽胞杆菌生物被膜形成能力评估领域，具体地说是涉及评估和研究芽胞杆菌是否具有生物被膜形成能力以及形成能力强弱的方法及所应用的培养基，为筛选促进生物被膜形成能力的物质以及进一步开发这一类型的芽胞杆菌用于生物农药和生物肥料提供支持。
技术介绍
生物被膜(b1film)指细胞通过胞外基质紧密结合在一起形成的群体。生物被膜为细菌提供保护，使细菌防御各种环境因子及其组合、形形色色的抗生素、捕食者和人类的免疫系统。芽胞杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性细菌，可以产生内生芽胞，在土壤和植物的表面普遍存在，同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无害，不污染环境。它生长速度快、营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖和与繁殖，而且生产芽胞杆菌制剂的工艺简单，制剂稳定，施用方便，存储期长，是一种理想的生防微生物。由于自然界获得的芽胞杆菌还需要在实验室开展进一步的评估，其中用于土传病害治理的芽胞杆菌要想发挥良好的防效，还需要具备良好的土壤和植物根际定殖能力。而芽胞杆菌能在土壤和植物根际良好定殖的关键是其生物被膜形成能力的强弱，因此评估芽胞杆菌类生防菌株生物被膜形成能力的强弱对于进一步开发芽胞杆菌用于生物农药或生物肥料的产业化开发具有重要意义。此外，一些针对土传病害的生物农药，由于施用时需要接种到土壤中，待其萌发并在土壤中定殖才能进一步发挥作用，而土壤环境条件复杂，不合适的土壤理化因素如pH、盐度、营养源以及微生物因素如病原菌分泌毒素的存在等，都会影响到芽胞的萌发并最终发挥效果。筛选和寻找促进芽胞杆菌在土壤和植物根际快速形成生物被膜的物质，有助于提高这一类生物农药或生物制剂的田间应用效果及其稳定性。在革兰氏阳性细菌中，枯草芽胞杆菌的生物被膜形成研究成为模式和典范。枯草芽胞杆菌最著名的特点是在饥饿和高种群密度时形成感受态和芽胞，除此之外，还发现许多枯草芽胞杆菌能够在固体平板上形成复杂具褶皱的菌落，并在液体表面形成薄皮，这种在固体表面或液体表面形成的结构即生物被膜。枯草芽胞杆菌生物被膜形成及其基因调控得到了深入的研究。目前被深入研究生物被膜形成机制的枯草芽胞杆菌菌株为NCIB3610菌株。枯草芽胞杆菌生物被膜的形成涉及到多种转录调控因子，其中最核心的转录调控因子是SinR、SinI和两种新鉴定的蛋白，YlbF和YmcA。转录调控因子SinR是控制枯草芽胞杆菌生物被膜形成转换的主调控因子。SinR在枯草芽胞杆菌细胞中组成型表达，并在运动的细胞中抑制控制基质产生基因的转录，间接促进细胞之间保持分开和运动。当条件有利于生物被膜形成时，SinR的活性受到措抗。SinI和两种新鉴定的蛋白(YlbF和YmcA)，直接和/或间接措抗SinR的活性，SinR活性降低后导致细胞的运动能力丧失，细胞之间形成链状并开始分泌胞外基质，并最终形成稳定的具有三维结构的生物被膜。胞外基质由胞外多糖(EPS)和蛋白质TasA组成。目前在微观水平对枯草芽胞杆菌生物被膜的研究依赖超薄切片技术和高放大倍数荧光显微镜技术。在宏观水平对枯草芽胞杆菌生物被膜形成的研究则依赖于枯草芽胞杆菌在不同液培养基表面形成的薄皮或固体培养基表面形成的菌落。目前常用的几种培养基配方如下:(I)DSM培养基:Hamon and Lazazzera(2001)报道了评估和研究枯草芽胞杆菌生物被膜形成的方法，在该文章中，作者使用了PVC材质的96孔微量滴定板作为培养容器，培养基配方(DSM)为:LB培养基加0.15M的硫酸铵、10mM的磷酸钾(pH7)、34mM梓檬酸钠、ImM硫酸锰和0.1%的葡萄糖。其测定不同时间点芽胞杆菌生物被膜形成强度时采用了结晶紫染色的方法，将微量滴定板中未粘附成膜的游离细胞去除，并用缓冲液(0.15M硫酸铵、10mM磷酸钾(pH7)、34mM梓檬酸钠、ImM硫酸锰)清洗。粘附到微孔中的细菌使用1%的结晶紫染色20min，多余的结晶紫去除并用水漂洗。结晶紫染色后的细胞用200yL由80%和20%丙酮组成的洗脱液溶解，并测定溶解液OD57q的读数，用于评估生物被膜厚度。这个方法非常适合与测定芽胞杆菌形成薄皮的能力。(2)MSgg培养基:Branda et al.(2004)在研究枯草芽胞杆菌生物被膜时提出了液体MSgg培养基，具体配方为5mM磷酸钾(pH7.0)、10mM磷酸丙基吗啉(pH7.0)、2mM氯化镁、700μΜ氯化钙、50μΜ氯化锰、50μΜ氯化铁、ΙμΜ氯化锌、2μΜ硫胺素、0.5%甘油、0.5%谷氨酸、50yg/mL色氨酸、50yg/mL苯丙氨酸。固体MSgg培养基在液体MSgg培养基中加入1.5%的琼月旨。培养容器为培养皿。枯草芽胞杆菌在液体MSgg上能够形成稳定的具有皱褶的薄皮，在固体MSgg培养基上则形成具有三维结构的菌落。(3)LB+Mn+甘油:Shemesh and Chai (2013)研究甘油和Mn促进枯草芽胞杆菌生物被膜形成研究时使用的培养基为LB培养基中加入I % (v/v)甘油和0.1mM硫酸锰。(4)MSN培养基:Beauregard et al.(2013)研究植物多糖对枯草芽胞杆菌薄皮形成影响时采用的培养容器为24孔微量滴定板，采用的培养基为MSN，配方为5mM磷酸钾(pH7.0)、0.1M磷酸丙基吗啉(pH7.0)，2mM氯化镁、0.05mM氯化锰、ΙμΜ氯化锌、2μΜ硫胺素、700μΜ氯化钙、0.2%氯化铵。用于测定芽胞杆菌根际定殖能力时，在其中加入0.05%的甘油，或加入0.0 5 %的植物多糖用于测定薄皮的形成。该培养基从MSgg培养基演变而来。由于培养基中未提供芽胞杆菌生长所需的碳源，芽胞杆菌接入上述培养基中不能形成薄皮，加入芽胞杆菌能够使用的碳源后，芽胞杆菌将会在微量滴定板中形成薄皮。上述4种培养基均可以用于定性或定量研究枯草芽胞杆菌生物被膜形成，其中DSM培养基比较适合研究薄皮，制备成固体培养基后，枯草芽胞杆菌不能生长出具有褶皱的菌落。MSgg培养基既适合薄皮也适合菌落的生长。LB+Mn+甘油的培养基也适合薄皮和菌落的生长。MSN培养基适合评估碳源与枯草芽胞杆菌薄皮形成关系。也可以用上述培养基培养出薄皮后，利用结晶紫染色的方法对菌株的生物被膜形成能力进行定量评估。但是，除了 MSN培养基属于专门设计用于评估生物被膜促进因子研究的培养基外，其它培养基因其本身就具备促进芽胞杆菌生物被膜形成能力，不适合用于生物被膜形成能力及促进因子的评估。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种快速便捷评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的培养基组合。本专利技术的该目的是通过如下方案实现的:—种评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的培养基，其特征在于，所述培养基包括:第一液体培养基，所述第一液体培养基包含的溶质及浓度为，10mM磷酸三钾，34mM柠檬酸钠，ImM硫酸镁，0.1mM硫酸铵，0.3%牛肉膏，0.5% NaCl，1%胰蛋白胨，0.1 %葡萄糖;在制备过程中，先将所述磷酸三钾溶入水并调整PH为7.0;所述第一液体培养基的最终pH为7.0;第二液体培养基，所述第二液体培养基包含的溶质及浓度为，10mM磷酸三钾，34mM柠檬酸钠，ImM硫酸镁，0.1mM硫酸铵，0.3%牛肉膏，0.5% NaCl，I本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的培养基，其特征在于，所述培养基包括：第一液体培养基，所述第一液体培养基包含的溶质及浓度为，100mM磷酸三钾，34mM柠檬酸钠，1mM硫酸镁，0.1mM硫酸铵，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％胰蛋白胨，0.1％葡萄糖；在制备过程中，先将所述磷酸三钾溶入水并调整pH为7.0；所述第一液体培养基的最终pH为7.0；第二液体培养基，所述第二液体培养基包含的溶质及浓度为，100mM磷酸三钾，34mM柠檬酸钠，1mM硫酸镁，0.1mM硫酸铵，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％细菌学蛋白胨，0.1％葡萄糖；在制备过程中，先将所述磷酸三钾溶入水并调整pH为7.0；所述第二液体培养基的最终pH为7.0。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：喻国辉，李一平，沈汉国，刘文，陈继敏，刘兰，
申请(专利权)人：珠海市现代农业发展中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。