使用专门捕获探针(HEATSEQ)的序列捕获方法技术

本发明专利技术是用于大量平行生产改进的MIP的新方法。对MIP的分子改进涵盖探针的制备、工作流、意味着样品特异性的独特序列元件的添加、和独特地鉴别存在于最初样品群体中的特定分子的序列标签。最后，本发明专利技术还与克服了基因座呈现和等位基因偏差二者的问题的经验优化策略组合。该改进的技术是可缩放的，且可以用于将包含单个基因座的扩增子的靶标扩大至靶向超过100万基因座。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
本专利技术涉及用于捕获基因组或复杂DNA样品的目标区域以实现在所述目标区域内发现的遗传多态性的有效测试和/或检测的方法的领域。有效地捕获基因组的目标区域的方法可以实现与疾病或其它性状有关的遗传多态性或其它特性的快速的测序介导的发现和检测。目前，利用双链连接物连接的测序文库作为靶标捕获的输入的基于杂交的技术是耗时的和资源集中的。传统的实现靶标捕获的基于分子倒置探针(MIP)的方法可以缩减测序之前的工作流时间，但是由于基因座扩增/呈现偏差、等位基因偏差和与特定测序平台关联的系统伪像（systematic artifact）而受到限制。专利技术概述本专利技术是用于大量平行生产改进的MIP的新方案。对MIP的分子改进涵盖探针的制备、工作流、意味着样品特异性的独特序列元件的添加、和独特地鉴别存在于最初样品群体中的特定分子的序列标签。最后，本专利技术还与克服了基因座呈现和等位基因偏差二者的问题的经验优化策略组合。该改进的技术是可缩放的，且可以用于将包含单个基因座的扩增子的靶标扩大至靶向超过100万基因座。附图说明通过结合附图参考本公开内容的实施方案的以下描述，本公开内容的特征和实现它们的方式将变得更明显，并且将更好地理解公开内容本身。图1的示意图描述了MIP前体、扩增的MIP前体和扩增产物的限制酶切消化。图2是酶消化产物的琼脂糖凝胶纯化。图3描绘了与基因组DNA的目标链杂交的70-merMIP探针和所述MIP探针的延伸/连接。图4是延伸/连接(即，具有“捕获的”产物)以后MIP探针的凝胶纯化。图5的图显示了具有20-mer靶区域的探针的熔点范围和具有可变长度靶区域的探针的熔点范围(平衡过Tm的)。图6的图显示了固定长度探针(插图)和平衡过Tm的可变长度探针(主图)的序列覆盖。图7的示意图描述了具有UID的MIP前体、所述MIP前体的扩增、扩增产物的切割和在序列捕获过程中使用的封闭寡核苷酸。图8描绘了具有UID序列的MIP探针与DNA靶标的杂交和MIP探针的环化。图9显示了延伸/连接以后MIP探针的凝胶纯化。图10描绘了UID序列的用途。图11的示意图描绘了MIP探针的合成。图12 (12A和12B)是使用MIP探针的工作流的描绘。图13描绘了样品索引(MID)用于鉴别样品来源的用途。图14描绘了UID序列用于事件计数的用途。图15显示了来自一个探针的UID标签的分布。图16证实了探针重新平衡的结果。尽管附图代表本公开内容的实施方案，但是附图不一定按比例绘制，并且可以放大某些特征以便更好地图解和解释本公开内容。本文中阐述的例证以一种形式说明了本公开内容的一个示例性实施方案，并且这样的例证不应解释为以任何方式限制本公开内容的范围。专利技术详述传统上，分子倒置探针(MIP)是在它们的末端处或附近具有与单链靶核苷酸序列的两个单独部分特异性地互补的区域的单链核酸探针。所述探针“倒置”，因为它们基本上呈现圆形构型，使得末端靶标特异性的部分与靶序列适当地对齐且互补，或相反，所述靶标“倒置”以便允许靶区域和靶标特异性的部分之间的相同相互作用。本专利技术提供了通过提供有用序列用于分析数据而对MIP的改进、用于制备这样的MIP的改进的合成方法、和用于优化MIP探针库的有用方法。本专利技术包括用于减小核酸样品的复杂性的核酸捕获探针集合，其中所述集合中的每个探针含有：第一末端序列，其与存在于复杂样品中的第一靶序列特异性地杂交；第二末端序列，其与存在于复杂样品中的第二靶序列特异性地杂交，其中所述第一靶序列和第二靶序列都位于相同靶链上；和连接所述第一末端序列和所述第二末端序列的接头序列，所述接头序列含有唯一标识符（Unique Identifier (UID)）序列，其中所述UID是随机地产生的标签序列，其在探针形成过程中通过随机核苷酸合成针对探针集合中的每个单个探针产生。本专利技术包括MIP探针，其具有改进的用于确定等位基因偏差、基因座扩增/呈现偏差和与特定测序平台关联的系统伪像的特征。此外，本专利技术还包括使用阵列作为制备MIP探针的模板来制备这样的改进的MIP探针的某些方法。在一些实施方案中，使用阵列作为MIP探针的模板来制备MIP探针。在某些实施方案中，本专利技术包括用无掩膜阵列合成（Maskless Array Synthesis (MAS)）制备MIP探针(参见Singh-Gasson等人, Nature Biotechnology, 17: 974-978, 1999，在此通过引用并入)。在一些实施方案中，使用用于优化探针设计的方法设计MIP探针。在某些实施方案中，使用探针再分布来设计探针库。通过在合成过程中增加或降低特定探针的相对浓度（通过在阵列表面上合成相同探针的多个副本）来执行探针再分布。在一些实施方案中，使用探针长度优化来设计探针库中的探针。在一些实施方案中，使用探针动力学优化来设计探针，例如使用Tm (熔化温度)来确定最佳探针设计。在一些实施方案中，所述MIP探针含有分子ID标签(MID)。这样的MID基本上是用于鉴别捕获核酸来源的样品的目的的“条形码”核酸序列。因而，所述MID序列允许通过样品特异性的标识符来鉴别原始样品，其中来自特定样品的每个捕获序列共有一个共同的条形码序列。可以以许多不同的方式将MID序列加给样品，所述方式包括与含有MID序列的衔接子序列连接，或通过使用含有MID序列的引物扩增。在某些实施方案中，所述MID条形码不存在于MIP探针中，直到所述引物使用含有引物位点和含有MID条形码的单独位点复制和延伸探针之后。在一些实施方案中，没有添加所述MID条形码，直到所述MIP探针已经与靶序列接触以后。当MIP探针(没有MID条形码)接触它的靶序列且特异性地杂交时，发生该实施方案的一个例子。通过延伸和连接，使所述MIP探针环化（circularized），然后使用具有另外MID条形码序列的引物复制/扩增环化的MIP探针。本专利技术包括用于降低核酸样品的复杂性的核酸捕获探针集合，其中所述集合中的每个探针。所述探针包含：第一末端序列，其与存在于复杂样品中的第一靶序列特异性地杂交，和第二末端序列，其与存在于复杂样品中的第二靶序列特异性地杂交。在该实施方案中，所述第一靶序列和第二靶序列都位于相同靶链上。所述探针还具有连接所述第一末端序列和所述第二末端序列的接头序列，所述接头序列包含唯一标识符(UID)序列。所述UID是随机地产生的标签序列，其在探针形成过程中通过化学衍生的随机核苷酸合成针对探针集合中的每个单个探针产生。在某些实施方案中，所述探针进一步包含MID条形码，其中为特定核酸样品使用的探针都含有相同的MID条形码序列。以此方式，可以追踪得自特定样品的所有结果。本专利技术的某些实施方案也涉及包括以下的方法：a)在阵列上合成MIP前体，其中所述前体包含一个或多个引物、一个或多个限制位点以及在MIP前体的一个末端附近的第一末端靶序列和在相对末端附近的第二末端靶序列；b)在溶液中扩增MIP前体；c)收集所述溶液；和d)使用一种或多种限制性酶消化扩增的前体以形成MIP探针。在某些实施方案中，所述MIP前体进一步包含唯一标识符(UID)序列。本专利技术的某些实施方案也涉及这样的方法，其中改变第一末端靶序列和/或第二末端靶序列的长度，本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸捕获探针的集合，其用于降低核酸样品的复杂性，其中所述集合中的每个探针包含：‑第一末端序列，其与存在于复杂样品中的第一靶序列特异性地杂交；‑第二末端序列，其与存在于复杂样品中的第二靶序列特异性地杂交，其中所述第一靶序列和第二靶序列都位于相同靶链上；和‑连接所述第一末端序列和所述第二末端序列的接头序列，所述接头序列包含唯一标识符(UID)序列，其中所述UID是随机地产生的标签序列，其在探针形成过程中通过随机核苷酸合成针对探针集合中的每个单个探针产生。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.02 US 61/8616951.核酸捕获探针的集合，其用于降低核酸样品的复杂性，其中所述集合中的每个探针包含：-第一末端序列，其与存在于复杂样品中的第一靶序列特异性地杂交；-第二末端序列，其与存在于复杂样品中的第二靶序列特异性地杂交，其中所述第一靶序列和第二靶序列都位于相同靶链上；和-连接所述第一末端序列和所述第二末端序列的接头序列，所述接头序列包含唯一标识符(UID)序列，其中所述UID是随机地产生的标签序列，其在探针形成过程中通过随机核苷酸合成针对探针集合中的每个单个探针产生。2.根据权利要求1所述的核酸探针，其中所述探针进一步包含MID条形码，其中特定核酸样品所用的探针都含有相同的MID条形码序列。3.根据权利要求1所述的核酸探针，其中通过化学衍生的随机合成产生UID序列。4.根据权利要求1所述的核酸探针，其中所述第一末端序列和/或所述第二末端序列的序列长度是不同的长度。5.一种方法，其包括：a)在阵列上合成MIP前体，其中所述前体包含一个或多个引物、一个或多个限制位点、以及在所述MIP...

【专利技术属性】
技术研发人员：T艾伯特，J诺顿，J帕特尔，D布格斯，V莱米切夫，M布罗克曼，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH