本发明专利技术涉及能够内化入细胞的肽分子，其中该肽分子：(a)具有至少10个，优选至少15个氨基酸残基的长度；(b)在它的一级氨基酸序列中包含至少25％，优选至少30％带正电荷的氨基酸残基；和(c)以具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ的TAT肽的内化效力的至少80％，优选至少90％的效力内化入细胞。本发明专利技术还涉及对应的编码这种肽的核酸分子，以及包含至少一个这种肽的组合物，该肽附着于一个或多个核酸分子、一个或多个肽或蛋白质、一个或多个小分子，和一个或多个纳米颗粒中的任一个，其中通过选自共价键和非共价键的连接来达到该附着。此外，本发明专利技术还涉及检测这种肽或这种组合物的内化行为的方法，其包括：(a)对一个或多个细胞施用该肽或组合物；和(b)检测该肽或组合物的内化。最后，本发明专利技术涉及这种肽或这种组合物在转化或转染一个或多个细胞中的用途，以及在预防和/或治疗选自癌症、免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、感染和炎性疾病的病症中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人细胞穿透肽(CPP)的鉴定和功能表征及其用途，尤其是作为转染载体。
技术介绍
细胞质膜是阻止细胞摄取非主动输入的大多数分子的有效屏障，因此也妨碍治疗性物质的定向递送。仅小范围具有特定分子量、极性和/或净电荷的分子能够(被动)扩散通过细胞膜。所有其他分子都必须例如通过受体介导的胞吞作用或通过结合ATP的转运分子主动转运。此外，还可以例如利用电穿孔、阳离子脂质/脂质体、显微注射、病毒递送或包封在聚合物中来人为迫使分子穿过细胞膜。但是，这些方法主要用来递送疏水分子。此夕卜，与这些方法相关的显著副作用及它们的适用性主要限于体外用途的事实妨碍了它们成为用于将药物或其他治疗活性剂递送至细胞来预防或治疗医学病症的有效工具。具体而言，定向递送的需要也已成为基于RNAi (RNA干扰)的药物研发中的主要挑战。这类药剂包含干扰引起疾病或促进疾病的基因表达的小RNA分子(例如siRNA、miRNA 或 shRNA)。2001 年在哺乳动物细胞中证实 RNAi (Elbashir，S.M.等(2001)Nature411,494-498)之后，很快认识到，可以利用此序列特异性转录后基因沉默机制来研发一类新的药剂，该药剂还可以是用于治疗迄今的治疗干预不易接近的疾病的有希望的手段(DeFougerolles, A.等(2007)Nat.Rev.Drug Discov.6,443-453)。但是，由于RNAi发生在细胞溶胶中，任何基于RNA的药物都必须穿过细胞膜来发挥其疗效。迄今已描述了几种方法来达到此目标，如使用脂质(Schroeder ;A.等(2010)J.1ntern.Med.267,9-21)、病毒载体(Liu, Y.P.和 Berkhout, B.(2009) Curr.Top.Med.Chem.9,1130-1143)和聚阳离子纳米颗粒(Howard, K.A.(2009)Adv.Drug Deliv.Rev.61,710-720)。用于使分子易位通过细胞膜的另一种方法是使用细胞穿透肽(CPP)(也称为蛋白质转导结构域(PTD)或膜易位序列(MTS);综述于例如Fonseca, S.B等(2009)Adv.DrugDeliv.Rev.61,953-964 ；Heitz, F.等(2009)Br.J.Pharmacol.157，195-206 中)。就它们的一级氨基酸序列和它们的结构二者而言，CPP是一组异源肽分子。CPP的突出实例包括 HIV-1TAT 易位结构域(Green ；M.和 Loewenstein，P.M.(1988) Cell 55，1179-1188)和来自果蝇属(Drosophila)的触角足(Antennapedia)蛋白质的同源域(Joliot ；A.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.美国 88，1864-1868)。确切的易位机制仍有争议。触角足蛋白质的突变研究显示，称为穿透肽(penetratin)或pAntp的16个氨基酸的序列(Derossi，D.等(1994) J.Biol.Chem.269，10444-10450)对膜易位而言是必要且充分。随后，开发了其他蛋白质衍生的CPP，如HIV-1Tat蛋白质的碱性序列(Vives，E.等(1997)J.Biol.Chem.272，16010-16017)。开发的合成肽是两亲性模型肽MAP (Oehlke，J.等(1998)Biochim.Biophys.Acta 141 4,127-139)。已显示反义DNA或肽核酸(PNA)与CPP的偶联在体内发挥希望的作用。但是，对于哪些特征是CPP发挥其易位功能必需的仍有疑问。一般而言，已在不同CPP之间发现了小的序列和/或结构相似性。到目前为止，唯一始终存在的特征是非常高的碱性(带正电荷)氨基酸含量产生净正电荷。因此，假定CPP最初与细胞膜中的脂质或蛋白质(蛋白聚糖)的带负电荷的首基(head group)结合。但是,一旦结合,该肽仍在膜结合区室内侧。进一步的摄取机制仍是广泛争论的问题。已提出，CPP或者“逆行”转运至ER，它们在ER中进入细胞易位装置(Fischer, R.等(2004) J.Biol.Chem.279，12625-12635)，或者它们直接跨膜易位(Rothbard, J.B.等(2005)Adv.Drug Deliv.Rev.57,495-504)。取决于内化机制，已知的CPP主要定位在细胞核中，或者在它们内化在小泡中的情况下，主要保留在这些小泡内侧，只有小部分释放进入细胞质。许多CPP对所应用的细胞具有严重副作用，考虑到衍生CPP的大多数蛋白质作为例如抗微生物物质或毒素发挥作用的事实，这是可以理解的。例如，CPP可以导致由膜破裂引起的细胞质泄露，且还可以干扰膜蛋白质正常发挥功能。CPP还可以显示细胞毒性作用，如 transportan,其影响 GTP 酶活性(Soomets, U.等(2000) Biochim.Biophys.Acta 1467,165-176)。此外，越来越多的证据显示，许多CPP仅在体内环境中不能满足的某些非常特异的条件下发挥它们的功能。另一缺点是，取决于靶细胞，CPP可以在细胞中快速降解。最后，由于许多已知的CPP衍生自非人蛋白质，常观察到毒性和/或免疫原性作用，其可以干扰这些肽的利用，例如在人类中用于治疗应用。因此，仍然存在对克服上述限制的改进的细胞穿透肽的需要。具体而言，存在对这样的细胞穿透肽的需要，该细胞穿透肽代表适宜的转染小泡或负荷(cargo)，使得能够高效地将诸如治疗剂的化合物递送入靶细胞而不产生显著的细胞毒性和/或免疫原性作用。此外，还存在对包含这类CPP的组合物以及对将这类CPP用作用于诊断和治疗应用的分子工具的方法的需要。因此，本专利技术的目的是提供这类CPP及对应的组合物和方法。专利技术概述在一方面，本专利技术涉及能够内化入细胞的肽分子，其中该肽分子:(a)具有至少10个，优选至少15个氨基酸残基的长度；(b)在其一级氨基酸序列中包含至少25%，优选至少30%带正电荷的氨基酸残基；和(c)以具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO:1)的TAT肽的内化效力的至少80%，优选至少90%的效力内化入细胞。在具体实施方案中，该肽的至少部分形成a -螺旋二级结构。优选地，该肽具有哺乳动物来源，尤其优选具有人来源。在其他优选实施方案中，该肽具有选自以下的氨基酸序列:GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA(SEQ ID NO:2) ； IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR (SEQ ID NO:3) ;YLKWRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD(SEQ ID NO:4) ；SKVRFCSGRKRPVRRRPEPQLKGIVTRLFS(SEQ ID NO:5) ；SMSVLEPGTAKKHKGGILRKGAKLFFRRRH(SEQ ID NO:6) QRKIGGRGRIISPYRTPVLRRHRYSIFRST(SEQ ID NO:7) ；QHVRIRVIKKKKVIMKKRKKLTLTRPTP LV(SEQ ID NO:8) !本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.14 EP 10165793.0;2010.12.15 EP 10195278.61.够内化入细胞的肽分子，其中所述肽分子: (a)具有至少10个，优选至少15个氨基酸残基的长度； (b)在它的一级氨基酸序列中包含至少25%，优选至少30%带正电荷的氨基酸残基；和 (c)以具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:1)的TAT肽的内化效力的至少80%，优选至少90%的效力内化入细胞。2.权利要求1的肽，其中所述肽的至少部分形成a-螺旋二级结构。3.权利要求1或2的肽，其中所述肽具有哺乳动物来源，优选具有人来源。4.权利要求1至3中任一项的肽，其具有选自以下的氨基酸序列: GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA (SEQ ID NO 2); IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR (SEQ ID NO: 3); YLKWRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD (SEQ ID NO: 4); SKVRFCSGRKRPVRRRPEPQLKGIVTRLFS (SEQ ID NO: 5); SMSVLEPGTAKKHKGGILRKGAKLFFRRRH (SEQ ID NO: 6); QRKIGGRGRIISPYRTPVLRRHRYSIFRST (SEQ ID NO 7); QHVRIRVIKKKKVIMKKRKK LTLTRPTPLV (SEQ ID NO: 8)； FHFFPRRPRIHFRFPNRPFVPSRCNHRFPF (SEQ ID NO: 9); FALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES (SEQ ID NO: 10):.和在其总长度内与SEQ ID NO:2至SEQ ID NO: 10中的任一个具有至少70%，优选至少80%总体序列同一性的氨基酸序列。5.权利要求4的肽，其具有选自以下的氨基酸序列: GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA (SEQ ID NO: 2); IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR (SEQ ID NO: 3);和在其 YLKWRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD (SEQ ...
【专利技术属性】
技术研发人员：U·布林克曼，A·哈斯，D·迈塞尔，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：
国别省市：
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