一种治疗肿瘤的药物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗肿瘤药物及含有这种药物的药物组合物和试剂盒，同时也公开了制备这种抗肿瘤药物的方法。本发明专利技术中的抗肿瘤药物具有体内代谢的稳定性，可用于治疗肿瘤或制备抗肿瘤药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种具有生物活性和代谢稳定性的含有血管内皮抑制素的复合物和缓释制剂以及它的制备方法。本专利技术还提供含有这种血管内皮抑制素复合物和缓释制剂的药物组合物以及含有这种血管内皮抑制素复合物的试剂盒。本专利技术还提供使用本专利技术中的血管内皮抑制素复合物、缓释制剂、药物组合和试剂盒来预防、诊断、治疗肿瘤，及制备抗肿瘤药物的方法。
技术介绍
新生血管形成是指新的毛细血管在原有的血管上的生成。肿瘤的生长和迁移依赖于新生血管的生成，将肿瘤中的微血管内皮细胞作为癌症治疗的靶点为治疗肿瘤提供了一种治疗方式(Folkman J.N Engl J Med 1971 ；285:1182-1186)。血管内皮抑制素(Endostatin)是胶原XVIII羧基端的一段分子量大小为20kDa的酶切产物。1997年美国哈佛大学Judah Folkman教授等人在血管内皮瘤细胞的培养基中发现此蛋白，它具有抑制血管内皮细胞増殖、迁移，和体内血管生成的活性。进ー步实验发现重组血管内皮抑制素可以抑制老鼠体内多种肿瘤的生长、转移，甚至能完全治愈肿瘤，而且不产生耐药性。其发挥活性的机理在于它通过抑制血管内皮细胞的生长，抑制了肿瘤组织附近的新生血管的生成，使得肿瘤组织得不到生长所必需的大量营养和氧气，最后停止生长或坏死(Folkman J.et al.Cell 1997 ;88:277-285 ;Folkman J.et al.Nature 1997 ；390:404-407)。通过基因工程制备的`重组人血管内皮抑制素可以作为肿瘤治疗药物，其临床试验表明它可以有效的抑制肿瘤生长。在中国，以非小细胞肺癌为主要适应症的临床试验表明它对于肿瘤的治疗效果比较突出。专利技术概述多肽和蛋白质类药物相比于化学药具有毒副作用小，不产生耐药性等优点。为了达到最高的体内活性，提高生物利用度，减少药物体内降解，通常蛋白药物采用静脉给药方式。但是对于分子量小的蛋白来说，通常静脉给药以后的体内半衰期很短。除了体内的蛋白降解过程以外，ー个重要的方面是小分子蛋白能够通过肾过滤的途径从体内很快的被消除。在血液中，水力半径超过白蛋白或是分子量大于约66，000道尔顿(66kDa)的蛋白通常可以稳定的保留在循环系统中。但是小分子却会通过肾小球过滤被很快的从血液中消除。所以，为了维持小分子量蛋白在血液中的有效治疗浓度，需要进行频繁的注射或点滴。这种治疗方式虽然能达到治疗的目的，但是却给病人带来了严重的不便与痛苦，提高了用药成本，对某些药物长期的使用还有可能产生ー些副作用，例如免疫反应。作为蛋白药物的血管内皮抑制素同样存在半衰期短，体内清除率高的缺点。目前的临床用药手段主要为频繁的静脉注射或点滴，通常为每天给药，而且需要长期用药，这使得病人的精神和经济负担都比较大。本专利技术的目的就在于改善该蛋白的体内代谢特征，使其具有更高的稳定性和较长的体内半衰期，甚至具有更高疗效，从而达到可以减少用药频率，降低用药成本，减轻病人的经济负担的目的。用高分子聚合物对蛋白进行修饰，它是改变和控制药物的动力学特性如半衰期、免疫学特征、毒理特性的常用方法。用来修饰蛋白的高分子聚合物具有水溶性好、生物相容性好、无或弱免疫原性等特征。其中聚こニ醇(polyethylene glycol, PEG)是应用最为普遍的ー种蛋白修饰分子。聚こニ醇分子具有两亲性，既可以溶解于水，又可以溶解于大多数的有机溶剂，具有无毒、无免疫原性、在水溶液中有高溶解性等性质，是被包括美国FDA、中国SFDA在内的很多国家的药品管理机构批准的可用于药物制备的高分子。将蛋白质与亲水性的高分子如聚こニ醇偶联，可増加蛋白稳定性、減少非特异性吸附和抗原性。当偶联物达到一定分子量时，可大大降低肾脏的排除效率，是延长蛋白质药物体内半衰期的有效方法(Frokjaer S.et al.Nat.Rev.Drug Discov.2005Apr 4(4):298-306;Harris JM.et al.Nat.Rev.DrugDiscov.2003 Mar 2(3):214-21)。最初的聚こニ醇修饰都是以氨基作为反应位点，主要包括蛋白的N端a -氨基和赖氨酸残基侧链上的e-氨基。这ー类反应的产物是ー个蛋白分子与ー个或多个PEG分子偶联。对于赖氨酸残基侧链e-氨基上的修饰也往往因为反应位点不特异而产生修饰后的同分异构体。目前，针对蛋白N端a-氨基和赖氨酸残基侧链e-氨基的等电点差异，又新开发出了只针对蛋白N端修饰的聚こニ醇修饰试剂，使得修饰位点一致，修饰产物组成均一。另ー种可用于聚こニ醇修饰的蛋白位点是半胱氨酸的巯基。由于巯基在蛋白中的数目通常少于氨基，所以这类修饰的位点更加特异。利用基因工程技术，现在可以在蛋白任何部位引入半胱氨酸作为特异的修饰位点。但是此类引入半胱氨酸作为修饰位点也是有一定的局限性，因为对某些本身带有半胱氨酸的蛋白可能会造成ニ硫键的错配或无法复性。另外蛋白的羧基也是一种常用的修饰位点(Veronese FM et al.DrugDiscov.Today.2005Nov I ;10(21):1451-8.)。聚こニ醇修饰技术已经成功地运用在许多蛋白类药物上，比较成功的包括:PEG-天冬酸胺酶(PEG-asparaginase) (Graham ML Adv.Drug Deliv.Rev.55,1293-1302 AvramisVassilios 1.et al.W09939732 and US6689762)、PEG-腺酐脱氨酶(PEG-adenosine deaminase) (Levy Y et al.J.Pediatr.113, 312-317 ；DavisS et al.ClinExp.1mmunol.46:649-652 ；Hershfield MS et al.N Engl J Med 316:589-596)和 PEG-干扰素(PEG-1nterferon a 2a> PEG-1nterferon a 2b 等)(BailonP etal.C.Bioconjug.Chem.12,195-202, Wang YS et al.Adv.Drug Deliv.Rev.54,547-570,Meng Xiantai et al.W02005077421,Van Vlasselaer Peter et al.W02004076474,BallonPascal Sebastian et al.US2004030101, KarasiewiczRobert et al.EP0593868)等等。其他代表性的高分子修饰剂有葡聚糖、聚蔗糖、淀粉、聚丙氨酸、こニ酸和丙ニ酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚こ烯吡咯烷酮、聚1，3_こニ醇次甲基醚、こ烯和顺丁烯ニ酰肼的共聚物、多聚唾液酸、环糊精等。将血液蛋白或其片段作为载体，与药用蛋白偶联或融合表达，从而起到增加蛋白分子量的目的，是另ー种延长药用半衰期的方法。例如用免疫球蛋白的Fe片段和目的蛋白偶联以延长其半衰期，例如将此方法用在Notch I受体蛋白(Kitajewsky Jan etal.TO2005111072)、促红 细胞生成素(EPO) (Gillies Stephen D et al.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰物与血管内皮抑制素形成的复合物，所述复合物具有比血管内皮抑制素更长的体内半衰期。

【技术特征摘要】
1.一种修饰物与血管内皮抑制素形成的复合物，所述复合物具有比血管内皮抑制素更长的体内半衰期。2.权利要求1的复合物，所述修饰物与血管内皮抑制素通过共价键连接。3.权利要求2的复合物，所述修饰物选自高分子聚合物、蛋白质分子或其片段、肽链、小分子或其他任何形式的化学物质。4.权利要求3的复合物，所述高分子聚合物选自聚烯醇类化合物、聚醚类化合物、聚こ烯吡咯烷酮、聚氨基酸(包括聚丙氨酸)、ニこ烯基醚与马来酸酐的共聚物、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺(N-(2_Hydroxypropyl)-methacrylamide)、葡聚糖及葡聚糖衍生物如硫酸葡聚糖、纤维素及纤维素的衍生物(包括甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉及淀粉衍生物、聚鹿糖、聚氧こ基多醇(polyoxyethylated polyol)、肝素或肝素片段、聚烃基こニ醇及其衍生物、聚烃基こニ醇和其衍生物的共聚物、聚こ烯基こ醚、聚羟こ基天冬酰月安(a, P-Poly((2-hydroxyethyl)-DL-aspartamide))> 聚羧酸脂(polycarboxylates)>氧化こ烯和甲醒的共聚物(poly oxyethylene-oxymethylenes)、聚丙烯酰吗啉(polyacryloyl morpholines)、氨基化合物与氧化烯烃的共聚物、聚透明质酸,聚环氧化物(polyoxiranes)、こニ酸与丙ニ酸的共聚物、聚1，3_こニ醇次甲基醚、こ烯和顺丁烯ニ酰肼的共聚物、多聚唾液酸、环糊精或其他药学上可接受的高分子聚合物。5.权利要求4的复合物，所述聚醚类化合物选自聚烷撑ニ醇(HO((CH2)xO)nH).聚丙ニ醇、聚氧化こ烯(HO((CH2)2O)nH),聚こ烯醇((CH2CHOH)n)或它们的衍生物。6.权利要求4的复合物，所述聚烯醇类化合物选自聚こニ醇(包括单甲基聚こニ醇、单羟基聚こニ醇)、聚こ烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇或它们的衍生物。7.权利要求6的复合物，所述聚烯醇类化合物为聚こニ醇。8.权利要求7的 复合物，所述聚こニ醇优选单甲基聚こニ醇。9.权利要求7或8的复合物，其特征为ー个血管内皮抑制素分子和一个或多个聚こニ醇分子偶联。10.权利要求7-9任一项的复合物，血管内皮抑制素与聚こニ醇偶联的位点是血管内皮抑制素的N-末端a -氨基、半胱氨酸残基侧链的巯基、天冬氨酸残基侧链的羧基、谷氨酸残基侧链的羧基、C-末端羧基中的ー种或是它们的组合。11.权利要求7-10任一项的复合物，其特征为ー个血管内皮抑制素分子与一个聚こニ醇分子偶联，偶联位点为血管内皮抑制素N-末端的a-氨基。12.权利要求7-10任一项的复合物，其特征为血管内皮抑制素分子与一个或多个聚こニ醇分子偶联，偶联的位点是血管内皮抑制素分子N-末端的a -氨基。13.权利要求7-10任一项的复合物，其特征为血管内皮抑制素分子与一个或多个聚こニ醇分子偶联，偶联方法为在血管内皮抑制素分子内部或其N-末端或C-末端附加半胱氨酸或是含有半胱氨酸的肽链，使得偶联位点为附加的半胱氨酸残基侧链上的巯基。14.权利要求7-10任一项的复合物，其特征为血管内皮抑制素分子与ー个或多个聚こニ醇分子偶联，偶联的位点是血管内皮抑制素天冬氨酸或谷氨酸残基侧链上的羧基或C-末端的羧基。15.权利要求7-14任一项的复合物，所述聚こニ醇分子是线性的或是分叉的。16.权利要求7-14任一项的复合物，所述聚こニ醇分子的平均分子量位于1，000到.100，000道尔顿之间，优选5，000到40，000道尔顿之间。17.权利要求3的复合物，所述蛋白选自血管内皮抑制素、白蛋白、免疫球蛋白、甲状腺结合蛋白、转甲状腺蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原或它们的片段及其组合。18.权利要求17的复合物，所述复合物是血管内皮抑制素和ー个或多个血管内皮抑制素偶联形成ニ聚体或多聚体，该偶联物可以是通过化学修饰得到的，或是通过融合表达得到的，或是通过其他方法得到的，其中的血管内皮抑制素优选人血管内皮抑制素或其片段。19.权利要求17的复合物，所述复合物是白蛋白偶联的血管内皮抑制素，其特征为一个血管内皮抑制素分子和ー个或多个白蛋白偶联，该偶联物可以是通过化学修饰得到的，或是通过融合表达得到的，或是通过其他方法得到的，其中的白蛋白优选人血清白蛋白或其片段。20.权利要求17的复合物，所述复合物是免疫球蛋白Fe片段偶联的血管内皮抑制素，其特征为ー个血管内皮抑制素分子和ー个或多个免疫球蛋白Fe片段偶联，该偶联物可以是通过化学修饰得到的，或是通过融合表达得到的，或是通过其他方法得到的，其中的Fe片段优选人免疫球蛋白IgG中的Fe区域的片段。21.权利要求3中的复合物，所述复合物是小分子或是小肽或是其他化合物修饰的血管内皮抑制素，其特征是该复合物具有同体内其他分子或成分反应或结合的活性，使得该聚合物可以在体内和其他成分形成更大的复合物。22.权利要求20中的复合物，所 述复合物带有具有反应活性的基团，可以和血液成分的氣基、轻基、疏基反应形成共价键。23.权利要求21中的复合物，所述具有反应活性的基团是马来酰亚胺，它可以和血液成分，例如白蛋白中的巯基反应。24.权利要求20中的复合物，和血液某些成分，例如白蛋白、免疫球蛋白有较强的亲和力，能相互形成更大的复合物。25.权利要求3中的复合物，所述复合物是其他分子或是小肽修饰的血管内皮抑制素，例如血管内皮抑制素被糖基化、磷酸化或酰基化的产物，其中修饰的位点是原来蛋白序列中存在的氧基酸残基，或是通过突变产生的氨基酸残基。26.权利要求1的复合物，所述修饰物与血管内皮抑制素通过非共价键相互作用，该复合物具有特定的组成式，其中的修饰物可以是蛋白、小分子或其他化学物质。27.管内皮抑制素或权利要求1-26任...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗永章，韩庆，雷清新，常国栋，付彦，
申请(专利权)人：清华大学，北京普罗吉生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：