半胱氨酸改造的抗体和偶联物制造技术

制备在重链或轻链中包含游离半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造抗体，即诱变亲本抗体的核酸序列及将一个或多个氨基酸残基用半胱氨酸替换，以便编码半胱氨酸改造抗体；表达半胱氨酸改造抗体；并分离半胱氨酸改造抗体。通过PHESELECTOR测定法鉴定出某些高度反应性半胱氨酸改造抗体。分离的半胱氨酸改造抗体可共价附着于捕捉标记、检测标记、药物部分、或固相支持物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】半胱氨酸改造的抗体和偶联物对相关申请的引用本申请是在37CFR§1.53(b)规定下提交的非临时申请，依照35USC§119(e)的规定要求2010年6月8日提交的流水号为61/352,728的美国临时申请的权益，将其引入本文作为参考。专利
本专利技术一般涉及用反应性半胱氨酸残基改造的抗体，且更具体地说，本专利技术涉及具有治疗或诊断应用的抗体。可以使半胱氨酸改造的抗体与化疗药；毒素；亲和配体，诸如生物素和检测标记，诸如荧光团偶联。本专利技术还涉及使用抗体和抗体-药物偶联物化合物在体外、原位和体内诊断或治疗哺乳动物细胞或相关病理性情况的方法。专利技术背景抗体药物偶联物(ADC)是有吸引力的靶向化疗分子，因为它们组合抗体和细胞毒性药物二者的理想特性，即通过将有力的细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞，由此增强它们的抗肿瘤活性。针对给定靶抗原的成功ADC开发取决于抗体选择、接头稳定性、细胞毒性药物效力和接头-药物偶联抗体的方式的优化。常规附着方式，即通过共价键连接，药物部分与抗体一般产生不均一的(heterogeneous)分子混合物，其中药物部分结合在抗体上的许多位点上。例如，细胞毒性药物一般与抗体通过抗体的通常大量的赖氨酸残基偶联，从而产生不均一的抗体-药物偶联物混合物。根据反应条件的不同，所述的不均一混合物一般含有抗体和0－约8或8以上附着的药物部分的分布。此外，在具有特定整数比的药物部分与抗体的偶联物各亚组内可能是不均一的混合物，其中药物部分结合在抗体上的不同位点上。分析和制备方法不足以分离和表征由偶联反应产生的不均一混合物中的抗体-药物偶联物类分子。抗体为较大的复杂的并且结构多样的生物分子，通常带有许多反应性官能基。其与接头试剂和药物-接头中间体的反应性取决于如下因素：诸如pH、浓度、盐浓度和共溶剂。此外，多步骤偶联过程因控制反应条件和表征反应剂和中间体方面的困难而可能不可再现。半胱氨酸硫醇在中性pH具有反应性，这与在接近pH7时质子化和亲核性降低的大部分胺类不同。由于游离硫醇(RSH,硫氢基)具有相对的反应性，所以带有半胱氨酸残基的蛋白质通常以其作为二硫化物-连接的寡聚体的氧化形式存在或具有内部桥连的二硫化物基团。抗体半胱氨酸硫醇一般对亲电子偶联反应剂比对抗体胺或羟基更具反应性，即更具亲核性。通过使蛋白质的不同氨基酸残基突变成半胱氨酸氨基酸的在半胱氨酸硫醇上的设计可能存在问题，特别是就未配对的(游离Cys)残基或那些相对易于进行反应或氧化的残基而言。在蛋白质的浓溶液中，无论是在大肠杆菌（E.coli）的周质中，还是在培养物上清液或部分或完全纯化的蛋白质中，蛋白质表面上的未配对的Cys残基可以配对并且氧化成分子内二硫化物和由此的蛋白质二聚体或多聚体。二硫化物二聚体的形成使得新的Cys无法与药物、配体或其它标记发生偶联反应。此外，如果蛋白质以氧化方式在新改造的Cys和已存在的Cys残基之间形成分子内二硫键，那么两种Cys基团对活性位点的参与和相互作用而言均无法利用。此外，可以通过错误折叠或丧失三级结构使蛋白质失活或赋予其非特异性(Zhang等(2002)Anal.Biochem.311:1-9)。在改造的半胱氨酸可供偶联但不扰乱免疫球蛋白折叠和装配或改变抗原结合和效应器功能的位点处具有半胱氨酸替代的抗体(ThioMab)(Junutula,etal.,2008bNatureBiotech.,26(8):925-932；Dornanetal(2009)Blood114(13):2721-2729；US7521541；US7723485；WO2009/052249)。然后，这些ThioMab可以经由改造的半胱氨酸硫醇基偶联细胞毒性药物以获得具有统一化学计量(约2个药物每个抗体)的ThioMab药物偶联物(TDC)。针对不同抗原的多种抗体的研究显示了TDC在异种移植物模型中像常规ADC一样有效，而且在有关临床前模型中在更高的剂量得到耐受。ThioMab药物偶联物改造成在抗体的不同部分(轻链-Fab、重链-Fab和重链-Fc)附着药物。由于它们的同质性和位点特异性偶联细胞毒性药物，TDC的体外和体内稳定性、功效和PK特性提供胜过常规ADC的独特优势。概述本专利技术包括分离的半胱氨酸改造的抗体，其在重链或轻链中包含游离半胱氨酸氨基酸。本专利技术的一个方面是制备分离的半胱氨酸改造的抗体的方法，即通过将一个或多个氨基酸残基用半胱氨酸替换来诱变亲本抗体的核酸序列，以便编码半胱氨酸改造的抗体；表达半胱氨酸改造的抗体；并分离半胱氨酸改造的抗体。本专利技术的另一个方面是分离的半胱氨酸改造的抗体的偶联物，其中抗体共价附着于捕捉标记、检测标记、药物部分、或固相支持物。附图简述附图1A表示通过X射线晶体坐标衍生的hu4D5Fabv7抗体片段的三维代表图。对重链和轻链的例示性改造的Cys残基的结构位置进行了编号(按照序列编号系统)。附图1B表示4D5v7fabH的与Kabat编号方案(下排)对比在N-末端开始的序列编号方案(上排)。Kabat编号插入由a、b、c标注。附图2A和2B表示通过与BSA(空心条柱)、HER2(具条纹的条柱)或链霉抗生物素(实心条柱)相互作用的PHESELECTOR测定法，使用在450nm处吸光度检测的hu4D5Fabv8和hu4D5Fabv8Cys突变体(ThioFab)噬菌体变体的结合测定值：(A)未生物素化噬菌体-hu4D5Fabv8和(B)生物素化噬菌体-hu4D5Fabv8(B)。附图3A和3B表示通过与BSA(空心条柱)、HER2(具条纹的条柱)和链霉抗生物素(实心条柱)相互作用的PHESELECTOR测定法，使用在450nm处吸光度检测的hu4D5Fabv8(左)和hu4D5Fabv8Cys突变体(ThioFab)的结合测定值：(A)未生物素化噬菌体-hu4D5Fabv8和(B)生物素化噬菌体-hu4D5Fabv8。轻链变体位于左侧，而重链变体位于右侧。硫醇反应性=链霉抗生物素结合的OD450nm÷HER2(抗体)结合的OD450nm。附图4A表示野生型hu4D5Fabv8上残基的表面可接近分数值(FractionalSurfaceAccessibilityValue)。轻链位点位于左侧，而重链位点位于右侧。附图4B表示通过在450nm处检测吸光度测定的与HER2(第2天)、链霉抗生物素(SA)(第2天)、HER2(第4天)和SA(第4天)的相互作用的生物素化的hu4D5Fabv8和hu4D5Fabv8Cys变体(ThioFab)的结合测定值。分离噬菌体-hu4D5Fabv8Cys变体并且储存在4°C。在第2天或第4天时进行生物素偶联，随后进行PHESELECTOR分析以便如实施例2中所述监测其与Her2和链霉抗生物素的相互作用并且探测改造的ThioFab变体上反应性硫醇的稳定性。附图5表示通过在450nm处检测吸光度测定的生物素-马来酰亚胺偶联的-hu4D5Fabv8(A121C)和未生物素化的野生型hu4D5Fabv8在结合链霉抗生物素和HER2中的结合测定值。在2ng和20ng测试每种Fab。附图6表示通过在450nm处检测生物素化的ABP-hu4D5Fabv8野生型(wt)和ABP-hu4D5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.08 US 61/352,7281.一种具有式I的抗体-药物偶联物(ADC)：Ab-(L-D)pI其中L为接头，D为药物部分，p为1、2、3、或4，且Ab为半胱氨酸改造的抗体，其包含游离半胱氨酸氨基酸和重链中选自的序列或轻链中选自的序列，其中所述序列中的半胱氨酸是游离半胱氨酸氨基酸，其中所述抗体经由所述游离半胱氨酸氨基酸通过接头部分(L)附着于D，且其中所述半胱氨酸改造的抗体在分离时具有0.8或更高的硫醇反应性值。2.权利要求1的ADC，其中所述半胱氨酸改造的抗体通过包括以下步骤的方法制备：(i)通过将一个或多个氨基酸残基用半胱氨酸替换来诱变亲本抗体的核酸序列，以便编码半胱氨酸改造的抗体；(ii)表达半胱氨酸改造的抗体；并(iii)分离半胱氨酸改造的抗体。3.权利要求2的ADC，其中诱变包括位点定向诱变。4.权利要求2的ADC，其中在选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上表达半胱氨酸改造的抗体。5.权利要求2的ADC，其中所述方法进一步包括：(i)使半胱氨酸改造的抗体与硫醇-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的半胱氨酸改造的抗体；并(ii)测量亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与捕捉介质的结合。6.权利要求5的ADC，其中所述硫醇-反应性亲和试剂包含生物素部分。7.权利要求5的ADC，其中所述硫醇-反应性亲和试剂包含马来酰亚胺部分。8.权利要求5的ADC，其中所述捕捉介质包含链霉抗生物素。9.权利要求1的ADC，其中所述半胱氨酸改造的抗体为包含清蛋白结合肽(ABP)的融合蛋白。10.权利要求9的ADC，其中所述ABP包含选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、和SEQIDNO:5的序列。11.权利要求1的ADC，其中所述半胱氨酸改造的抗体选自单克隆抗体、抗体片段、双特异性抗体、嵌合抗体、人抗体、和人源化抗体。12.权利要求11的ADC，其中所述抗体片段为Fab片段。13.权利要求11的ADC，其中所述半胱氨酸改造的抗体为抗HER2抗体。14.权利要求1的ADC，其中所述半胱氨酸改造的抗体结合受体(1)-(36)中的一种或多种：(1)BMPR1B；(2)E16；(3)STEAP1；(4)MUC16；(5)MSLN；(6)Napi3b；(7)Sema5b；(8)PSCAhlg；(9)ETBR；(10)MSG783；(11)STEAP2；(12)TrpM4；(13)CRIPTO；(14)CD21；(15)CD79b；(16)FcRH2；(17)HER2；(18)NCA；(19)MDP；(20)IL20Rα；(21)Brevican；(22)EphB2R；(23)ASLG659；(24)PSCA；(25)GEDA；(26)BAFF-R；(27)CD22；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：S巴克塔，JR朱纳图拉，
申请(专利权)人：基因泰克公司，
类型：
国别省市：