在竞争性抑制剂保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法技术

一种在竞争性抑制剂保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，其特征在于用黄嘌呤或氧嗪酸等竞争性抑制剂，在碱性硼酸盐或磷酸盐缓冲液中用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶，可用但不限于用聚乙二醇单甲醚的丁二酸活泼酯、聚乙二醇单甲醚的碳酸活泼酯、聚乙二醇单甲醚甲磺酸酯、聚乙二醇单甲醚醛；所用竞争性抑制剂浓度要达到其抑制常数1倍以上，所用活化聚乙二醇要达到待修饰尿酸酶中氨基摩尔总量的6倍以上才有明显保护作用；在竞争性抑制剂保护下聚乙二醇修饰后保留的尿酸酶活性可显著提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用尿酸酶竞争性抑制剂结合在尿酸酶活性中心后，降低活性中心必须氨基或酚羟基同针对氨基的活化聚乙二醇反应活性，从而保护尿酸酶避免其在被聚乙二醇修饰时失活的方法；该方法主要用于制备聚乙二醇修饰的尿酸酶作为药用尿酸酶原料。专利技术的
技术介绍
尿酸酶是治疗痛风、肿瘤溶解综合症的特效药物，并可用于慢性肾脏病治疗；尿酸酶的这类应用都需要将其进行聚乙二醇(PEG)修饰制剂，以降低其免疫原性并延长其体内循环半衰期。Pegloticase是猪尿酸酶重组体经mPEG1(lk修饰制得，临床主要用于治疗顽固性痛风[14]。尿酸酶进行聚乙二醇修饰时常用活化聚乙二醇修饰其氨基(附图1);为减少修饰异构体并尽可能完全修饰封闭其免疫原性位点，需用大量活化PEG针对其氨基完全修饰。这类活化PEG也可同尿酸酶的酚羟基反应；这种针对尿酸酶氨基的活化PEG修饰过程会造成尿酸酶活性下降，甚至完全失活。所以，如何提高PEG修饰后尿酸酶的活性是一个技术难题。 提高酶蛋白质PEG修饰后活性的关键是保护活性中心及附近氨基酸残基不被修饰。通过定点突变改造将可修饰的必须氨基酸残基改成不能反应的残基并保留活性，是避免修饰后尿酸酶活性下降的有效方法之一；但其技术难度大，而且不明确尿酸酶的结构功能关系时难以实施。曾报道对尿酸酶进行PEG修饰时用底物尿酸可提高修饰尿酸酶的活性；但修饰过程中尿酸酶作用下尿酸很快被消耗而失去保护作用。尿酸的竞争性抑制剂也结合在活性中心但不会被尿酸酶作用而消耗，故能更好保护尿酸酶避免针对氨基的活化PEG修饰时失活。专利技术概述本专利技术的核心思想是碱性条件下用针对氨基的活化PEG修饰尿酸酶时，用尿酸酶的带负电荷的竞争性抑制剂结合在尿酸酶的活性中心，改变活性中心及其附近必须氨基或酚羟基的构象或相互作用状态，使其同针对氨基的活化PEG的反应活性显著下降，从而降低必须氨基及酚羟基被这类针对氨基的活化PEG修饰的比例而避免该尿酸酶在活化PEG修饰过程中失活，提高所得PEG修饰尿酸酶相对于未修饰尿酸酶的活性比例。本专利技术所述提高针对氨基的活化PEG修饰后尿酸酶活性的方法，可用于天然尿酸酶和重组表达的尿酸酶；应用中所需要的针对氨基的活化PEG，可参照文献方法自主合成，也可从国内的北京凯正生物工程发展有限责任公司(www.kaizhenRbiotech.com)、北京键凯科技有限公司(http://www.jenkem.com/cn/)购买。本专利技术应用中的特征在于按如下步骤进行:(一 )、将各种方式活化可修饰氨基的聚乙二醇衍生物简称为活化聚乙二醇；按所用活化聚乙二醇平均分子量和质量计算所用活化聚乙二醇的摩尔量；按所用纯化尿酸酶的质量、亚基分子量及其每个亚基中所含来自赖氨酸残基的氨基和N端氨基数量计算单位质量的尿酸酶中氨基的摩尔量； ( 二 )、将浓度在0.01 0.20mol/L且pH在7.5 9.5间的硼酸钠缓冲液或浓度在0.01 0.20mol/L且pH在7.0 8.5间磷酸钠缓冲液，在2度到25度之间恒温5到30分钟；当所用缓冲液体积很大时搅拌缓冲液以快速达到所需温度；如用活化的聚乙二醇羧酸酯，如丁二酸衍生物酯，则缓冲液pH控制在8.0到9.2间且温度不高于25度；如用活化的聚乙二醇的碳酸酯，则缓冲液pH控制在7.5到8.5间且温度控制在不高于20度；(三)、选择黄嘌呤、氧嗪酸钾、8-氮杂黄嘌呤及其它不含伯氨基及酚羟基的尿酸酶竞争性抑制剂中的一种，溶解在步骤(二)恒温的缓冲液中达到其对拟修饰尿酸酶抑制常数的2倍以上或达到饱和；尿酸酶竞争性抑制剂称为对尿酸酶进行聚乙二醇修饰的保护剂；将保护剂的缓冲液仍然在相同温度下恒温；(四)、将纯化的原核或真核尿酸酶，称取适量加入到步骤(三)所得含保护剂缓冲液中，温和搅拌5分钟到20分钟，获得尿酸酶溶液；控制所用尿酸酶的量，使得其浓度在0.5g/L以上而在100g/L以下保证全部溶解；此步骤所用尿酸酶的量用于计算下一步所需聚乙二醇活泼酯的摩尔量；将溶液在相同温度下恒温；(五)、用步骤(四)所用尿酸酶的量计算其所含氨基的总量；称取适量活化聚乙二醇固体，使其摩尔量达到来自步骤(三)所用尿酸酶的氨基总量的6倍以上；(六)、在步骤(二)设定的温度下，温和搅拌或震荡反应10分钟到30小时；将所得溶液对浓度为10 50mmol/L的相同pH缓冲液透析，得到聚乙二醇修饰的尿酸酶溶液或进一步超滤浓缩后冷冻干燥得到粉末状固体；应用实施例实施例1:氧嗪酸钾对PEG单甲醚5000(缩写为mPEG5k)的N-羟基琥珀酰亚胺活化碳酸酯修饰重组表达苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶保护作用(PEG平均分质量为5000Dalton)(一)、将0.05mol/L且pH为8.5硼酸钠缓冲液在摄氏4度搅拌恒温60分钟；( 二 )、将氧嗪酸钾配成lOmmol/L储备液在相同温度下恒温后加入步骤(一)缓冲液中，达到系列不同的浓度(附图2)；(三)、将纯化的重组表达苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶，称取适量加入到步骤(二)所得含氧嗪酸钾的缓冲液中，温和搅拌20分钟，获得尿酸酶溶液；控制所用尿酸酶的量，使其浓度在1.5g/L左右(可波动0.2g/L)；(五)、购买对N-羟基琥珀酰亚胺活化mPEG5k碳酸酯，称取其固体达到来自步骤(三)所用尿酸酶的氨基摩尔总量的12倍；将该活化PEG固体直接以每批约IOmg的量用药匙分批加入到步骤(三)所得尿酸酶溶液中，边加边中速搅拌；(六)、在摄氏4度下温和搅拌反应30分钟；取所得修饰尿酸酶，参照文献用2，4，6，-三硝基苯磺酸测定氨基量；用0.075mmol/L尿酸和pH9.2的0.20mol/L硼酸钠缓冲液在25度测定293nm吸收变化检测尿酸酶活性；以加入活化PEG修饰剂之前的活性和氨基量为100%，计算剩余氨基量和活性对不同氧嗪酸浓度的响应；(七)、结果如附图2所示；氧嗪酸在摄氏4度时对此尿酸酶的抑制常数接近1.0umol/L ;可见氧嗪酸钾浓度越高则保护作用越强，剩余尿酸酶活性越高，但该尿酸酶的氨基被修饰程度随氧嗪酸浓度的变化没有发生显著变化。实施例2:黄嘌呤对PEG单甲醚5000(缩写为mPEG5k)的N-羟基琥珀酰亚胺活化丁二酸酯修饰重组表达苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶保护作用(PEG平均分质量为5000Dalton)(一)、将0.05mol/L且pH为8.5硼酸钠缓冲液在摄氏4度搅拌恒温60分钟；( 二)、将黄嘌呤配成20mmol/L 二甲亚砜储备液在相同温度下恒温后加入步骤(一)缓冲液中，达到系列不同的浓度(附图3);控制二甲亚砜终浓度低于4% ；(三)、将纯化的重组表达苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶，称取适量加入到步骤(二)所得含黄嘌呤的缓冲液中，温和搅拌20分钟，获得尿酸酶溶液；控制所用尿酸酶的量，使其浓度在1.5g/L左右；(五)、购买N-羟基琥珀酰亚胺活化mPEG5k丁二酸酯，称取其固体达到来自步骤(三)所用尿酸酶的氨基摩尔总量的12倍；将该活化PEG固体直接以每批约IOmg的量用药匙分批加入到步骤(三)所得尿酸酶溶液中，边加边中速搅拌；(六)、在摄氏4度下温和搅拌反应30分钟；取所得修饰尿酸酶，参照文献用2，4，6，-三硝基苯磺酸测定氨基量；用0.075mmol/L尿酸和pH9.2的0.20mol/L硼酸钠缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在竞争性抑制剂结合保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，其特征在于按如下步骤进行：(一)、将各种方式活化可修饰氨基的聚乙二醇衍生物简称为活化聚乙二醇；按所用活化聚乙二醇平均分子量和质量计算所用活化聚乙二醇的摩尔量；按所用纯化尿酸酶的质量、亚基分子量及其每个亚基中所含来自赖氨酸残基的氨基和N端氨基数量计算单位质量的尿酸酶中氨基的摩尔量，或测定其氨基含量；(二)、将浓度在0.01～0.20mol/L且pH在7.5～9.5间的硼酸钠缓冲液或浓度在0.01～0.20mol/L且pH在7.0～8.5间磷酸钠缓冲液，在2度到25度之间恒温5到120分钟；当所用缓冲液体积很大时搅拌缓冲液以快速达到所需温度；如用活化的聚乙二醇羧酸酯，如丁二酸衍生物酯，则缓冲液pH控制在8.0到9.2间且温度不高于25度；如用活化的聚乙二醇的碳酸酯，则缓冲液pH控制在7.5到9.0间且温度控制在不高于20度；(三)、选择黄嘌呤、氧嗪酸钾、8?氮杂黄嘌呤及其它不含伯氨基及酚羟基的尿酸酶竞争性抑制剂中的一种，溶解在步骤(二)恒温的缓冲液中达到其对拟修饰尿酸酶抑制常数的2倍以上或达到饱和；尿酸酶竞争性抑制剂称为对尿酸酶进行聚乙二醇修饰的保护剂；将保护剂的缓冲液仍然在相同温度下恒温；(四)、将纯化的原核或真核尿酸酶，称取适量加入到步骤(三)所得含保护剂缓冲液中，温和搅拌5分钟到20分钟，获得尿酸酶溶液；控制所用尿酸酶的量，使得其浓度在0.5g/L以上而在100g/L以下保证全部溶解；此步骤所用尿酸酶的量用于计算下一步所需聚乙二醇活泼酯的摩尔量；将溶液在相同温度下恒温；(五)、用步骤(四)所用尿酸酶的量计算其所含氨基的总量；称取适量活化聚乙二醇固体，使其摩尔量达到来自步骤(三)所用尿酸酶的氨基总量的6倍以上；(六)、在步骤(二)设定的温度下，温和搅拌或震荡反应10分钟到30小时；将所得溶液对浓度为10～50mmol/L的相同pH缓冲液透析除去竞争性抑制剂得到聚乙二醇修饰的尿酸酶溶液，或进一步超滤浓缩后冷冻干燥得到粉末状修饰产物。...

【技术特征摘要】
1.一种在竞争性抑制剂结合保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，其特征在于按如下步骤进行: (一)、将各种方式活化可修饰氨基的聚乙二醇衍生物简称为活化聚乙二醇；按所用活化聚乙二醇平均分子量和质量计算所用活化聚乙二醇的摩尔量；按所用纯化尿酸酶的质量、亚基分子量及其每个亚基中所含来自赖氨酸残基的氨基和N端氨基数量计算单位质量的尿酸酶中氨基的摩尔量，或测定其氨基含量； (二)、将浓度在0.0l 0.20mol/L且pH在7.5 9.5间的硼酸钠缓冲液或浓度在0.01 0.20mol/L且pH在7.0 8.5间磷酸钠缓冲液，在2度到25度之间恒温5到120分钟；当所用缓冲液体积很大时搅拌缓冲液以快速达到所需温度；如用活化的聚乙二醇羧酸酯，如丁二酸衍生物酯，则缓冲液pH控制在8.0到9.2间且温度不高于25度；如用活化的聚乙二醇的碳酸酯，则缓冲液pH控制在7.5到9.0间且温度控制在不高于20度； (三)、选择黄嘌呤、氧嗪酸钾、8-氮杂黄嘌呤及其它不含伯氨基及酚羟基的尿酸酶竞争性抑制剂中的一种，溶解在步骤(二)恒温的缓冲液中达到其对拟修饰尿酸酶抑制常数的2倍以上或达到饱和；尿酸酶竞争性抑制剂称为对尿酸酶进行聚乙二醇修饰的保护剂；将保护剂的缓冲液仍然在相同温度下恒温； (四)、将纯化的原核或真核尿酸酶，称取适量加入到步骤(三)所得含保护剂缓冲液中，温和搅拌5分钟到20分钟，获得尿酸酶溶液；控制所用尿酸酶的量，使得其浓度在0.5g/L以上而在100g/L以下保证全部溶解；此步骤所用尿酸酶的量用于计算下一步所需聚乙二醇活泼酯的摩尔量；将溶液在相同温度下恒温； (五)、用步骤(四)所用尿酸酶的量计算其所含氨基的总量；称取适量活化聚乙二醇固体，使其摩尔量达到来自步骤(三)所用尿酸酶的氨基总量的6倍以上； (六)、在步骤(二)设定的温度下，温和搅拌或震荡反应10分钟到30小时；将所得溶液对浓度为10 50mmol/L的相同pH缓冲液透析除去竞争性抑制剂得到聚乙二醇修饰的尿酸酶溶液，或进一步超滤浓缩后冷冻干燥得到粉末状修饰产物。2.按照权利要求1所述在竞争性抑制剂结合保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，其特征在于: (一)、用尿酸酶竞争性抑制...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖飞，杨晓兰，张纯，刘红博，高昂，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：