在竞争性抑制剂保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法技术

一种在竞争性抑制剂保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，其特征在于用黄嘌呤或氧嗪酸等竞争性抑制剂，在碱性硼酸盐或磷酸盐缓冲液中用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶，可用但不限于用聚乙二醇单甲醚的丁二酸活泼酯、聚乙二醇单甲醚的碳酸活泼酯、聚乙二醇单甲醚甲磺酸酯、聚乙二醇单甲醚醛；所用竞争性抑制剂浓度要达到其抑制常数1倍以上，所用活化聚乙二醇要达到待修饰尿酸酶中氨基摩尔总量的6倍以上才有明显保护作用；在竞争性抑制剂保护下聚乙二醇修饰后保留的尿酸酶活性可显著提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用尿酸酶竞争性抑制剂结合在尿酸酶活性中心后，降低活性中心必须氨基或酚羟基同针对氨基的活化聚乙二醇反应活性，从而保护尿酸酶避免其在被聚乙二醇修饰时失活的方法；该方法主要用于制备聚乙二醇修饰的尿酸酶作为药用尿酸酶原料。专利技术的
技术介绍
尿酸酶是治疗痛风、肿瘤溶解综合症的特效药物，并可用于慢性肾脏病治疗；尿酸酶的这类应用都需要将其进行聚乙二醇(PEG)修饰制剂，以降低其免疫原性并延长其体内循环半衰期。Pegloticase是猪尿酸酶重组体经mPEG1(lk修饰制得，临床主要用于治疗顽固性痛风[14]。尿酸酶进行聚乙二醇修饰时常用活化聚乙二醇修饰其氨基(附图1);为减少修饰异构体并尽可能完全修饰封闭其免疫原性位点，需用大量活化PEG针对其氨基完全修饰。这类活化PEG也可同尿酸酶的酚羟基反应；这种针对尿酸酶氨基的活化PEG修饰过程会造成尿酸酶活性下降，甚至完全失活。所以，如何提高PEG修饰后尿酸酶的活性是一个技术难题。 提高酶蛋白质PEG修饰后活性的关键是保护活性中心及附近氨基酸残基不被修饰。通过定点突变改造将可修饰的必须氨基酸残基改成不能反应的残基并保留活性，是避免修饰后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在竞争性抑制剂结合保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，其特征在于按如下步骤进行：(一)、将各种方式活化可修饰氨基的聚乙二醇衍生物简称为活化聚乙二醇；按所用活化聚乙二醇平均分子量和质量计算所用活化聚乙二醇的摩尔量；按所用纯化尿酸酶的质量、亚基分子量及其每个亚基中所含来自赖氨酸残基的氨基和N端氨基数量计算单位质量的尿酸酶中氨基的摩尔量，或测定其氨基含量；(二)、将浓度在0.01～0.20mol/L且pH在7.5～9.5间的硼酸钠缓冲液或浓度在0.01～0.20mol/L且pH在7.0～8.5间磷酸钠缓冲液，在2度到25度之间恒温5到120分钟；当所用缓冲液体积很大时搅拌缓冲液以快速...

【技术特征摘要】
1.一种在竞争性抑制剂结合保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，其特征在于按如下步骤进行: (一)、将各种方式活化可修饰氨基的聚乙二醇衍生物简称为活化聚乙二醇；按所用活化聚乙二醇平均分子量和质量计算所用活化聚乙二醇的摩尔量；按所用纯化尿酸酶的质量、亚基分子量及其每个亚基中所含来自赖氨酸残基的氨基和N端氨基数量计算单位质量的尿酸酶中氨基的摩尔量，或测定其氨基含量； (二)、将浓度在0.0l 0.20mol/L且pH在7.5 9.5间的硼酸钠缓冲液或浓度在0.01 0.20mol/L且pH在7.0 8.5间磷酸钠缓冲液，在2度到25度之间恒温5到120分钟；当所用缓冲液体积很大时搅拌缓冲液以快速达到所需温度；如用活化的聚乙二醇羧酸酯，如丁二酸衍生物酯，则缓冲液pH控制在8.0到9.2间且温度不高于25度；如用活化的聚乙二醇的碳酸酯，则缓冲液pH控制在7.5到9.0间且温度控制在不高于20度； (三)、选择黄嘌呤、氧嗪酸钾、8-氮杂黄嘌呤及其它不含伯氨基及酚羟基的尿酸酶竞争性抑制剂中的一种，溶解在步骤(二)恒温的缓冲液中达到其对拟修饰尿酸酶抑制常数的2倍以上或达到饱和；尿酸酶竞争性抑制剂称为对尿酸酶进行聚乙二醇修饰的保护剂；将保护剂的缓冲液仍然在相同温度下恒温； (四)、将纯化的原核或真核尿酸酶，称取适量加入到步骤(三)所得含保护剂缓冲液中，温和搅拌5分钟到20分钟，获得尿酸酶溶液；控制所用尿酸酶的量，使得其浓度在0.5g/L以上而在100g/L以下保证全部溶解；此步骤所用尿酸酶的量用于计算下一步所需聚乙二醇活泼酯的摩尔量；将溶液在相同温度下恒温； (五)、用步骤(四)所用尿酸酶的量计算其所含氨基的总量；称取适量活化聚乙二醇固体，使其摩尔量达到来自步骤(三)所用尿酸酶的氨基总量的6倍以上； (六)、在步骤(二)设定的温度下，温和搅拌或震荡反应10分钟到30小时；将所得溶液对浓度为10 50mmol/L的相同pH缓冲液透析除去竞争性抑制剂得到聚乙二醇修饰的尿酸酶溶液，或进一步超滤浓缩后冷冻干燥得到粉末状修饰产物。2.按照权利要求1所述在竞争性抑制剂结合保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，其特征在于: (一)、用尿酸酶竞争性抑制...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖飞，杨晓兰，张纯，刘红博，高昂，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：