本发明专利技术涉及用于生产可溶形式的抗体的重组方法，所述抗体结合ＣＤ２０，用于治疗患有复发的或难治的、低级的或滤泡的、ＣＤ２０阳性Ｂ细胞非何杰金淋巴瘤（ＮＨＬ）的患者。所述治疗将包括免疫活性抗ＣＤ２０抗体；或放射性标记的抗ＣＤ２０抗体和／或协同策略的使用，所述协同策略中标记和非标记抗体将用于ＮＨＬ治疗。该方法描述了编码抗－ＣＤ２０的核酸序列的从头合成、构建的核酸序列向感受态细菌中的转化、以及构建的核酸序列向哺乳动物表达载体中的亚克隆，以表达期望的蛋白质。包含与感兴趣的基因相连的控制元件的ＤＮＡ构建体已被公开。感兴趣的核酸序列已经密码子优化，以允许在适合的哺乳动物宿主细胞中表达。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于B细胞淋巴瘤治疗的 针对CD20的单克隆抗体的生产方法专利
本专利技术涉及用于生产可溶形式的抗体的重组方法，所述抗体结合 CD20，用于治疗患有复发的或难治的、低级的或滤泡的、CD20阳性B 细胞非何杰金淋巴瘤(NHL )的患者。所述治疗将包括免疫活性抗CD20 抗体；或放射性标记的抗CD20抗体和/或协同策略的使用，所述协同 策略中标记和非标记抗体将用于NHL治疗。该方法描述了编码抗 -CD20的核酸序列的从头合成、构建的核酸序列向感受态细菌中的转 化、以及构建的核酸序列向哺乳动物表达载体中的亚克隆，以表达期 望的蛋白质。包含与感兴趣的基因相连的控制元件的DNA构建体已被 公开。感兴趣的核酸序列已经密码子优化，以允许在适合的哺乳动物 宿主细胞中表达。专利技术背景抗体已经被公认为是以高度的特异性和亲和性来识别并靶向几乎 任何分子的有力工具。单克隆抗体(mAbs)已经被用作体外诊断剂， 因而容i午用于RIA、 ELISA免疫细J包病理法和流式细I包术的试剂的世 界性标准化。单克隆抗体也已经广泛地用于肿瘤抗原的体内定位以及 癌症的免疫治疗。这种难题已经通过两种基本类型的抗体的开发来解决。第一种类 型，称为嵌合抗体，其中仅鼠恒定结构域被人源的等效结构域替换 (Morrison et al,P.N.A.S., 1984， 81, 6851-6855; Boulianne et al, Nature, 1985, 314, 268-270;和Neuberger et al, Nature, 1985, 314, 268-270)。 第二种类型是其中鼠恒定结构域和鼠框架区都被人源的等效结构域和 区域替换。该第二种抗体被称为人源化的或CDR移植抗体(Jones et al, Nature, 1986, 321， 522-525;和Riechmann et al， Nature, 1988, 332, 323-327)。例如，对于治疗用途，人IgGl和大鼠IgG2b是当前偏爱的 同种型。进一步地，在人IgG同种型中，IgGl和IgG3似乎对于补体和 细胞介导的裂解最有效，因而用于杀死肿瘤细胞。人抗体无需"人源化，，，然而分泌人抗体的细胞系是非常不稳定的， 一般-皮证明不适合大 规模生产。为了产生足够量的抗体用于完全的临床使用，期望的是采用有效 的重组表达系统。由于骨髓瘤细胞代表了专用于抗体生产和分泌的天 然宿主，来自骨髓瘤细月包的细胞系已经;故用于重组抗体的表达。通常， 需要基于免疫球蛋白基因调节元件的复杂载体设计，并且高度可变的最终表达水平已被报道(Winter etal, Nature, 1988, 332, 323-327; Weidleetal, Gene， 1987， 60, 205-216; Nakatani et al, Bio/Technology, 1989, 7, 805-810;和Gillies et al, Bio/Technology, 1989， 7, 799-804)。可选择的哺乳动物表达系统是通过使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞提 供的那些。使用这些细胞容许几种治疗蛋白的大量产生，用于研究和 临床使用(Kaufman et al， Mol.Cell.Biol， 1985, 5, 1750-1759;和 Zettlmeissl et al, Bio/Technology, 1987, 5, 720-725 )。然而，《艮少情 况下使用这些细胞用于抗体的表达，迄今为止报道的鼠抗体表达水平 是很低的,约0.01-0.1 mu.g/ml (Weidleetal, Gene, 1987， 51, 21-29; 和Feysetal, Int.J.Cancer， 1988, 2, 26-27)。抗CD20抗体特异性地结合抗原CD20 (人B淋巴细胞限制的分化 抗原，Bp35),为具有约35 kD分子量位于前B淋巴细胞和成熟B淋 巴细月包上的疏水性5争膜蛋白。该抗原还在〉90%的B细l包非何杰金'淋巴 瘤(NHL)上表达，但未在造血干细胞、原B细胞、正常血浆细胞或 其他正常组织上发现。CD20调节细胞周期起始和分化的活化过程中的 早期步骤，并且可能作为钙离子通道起作用。CD20不从细胞表面脱落， 在抗体结合时不一皮内在化。游离CD20抗原未在循环中发现。抗CD20 抗体通过征募身体的天然防雄卩来攻击和杀死其经由CD20抗原而结合 的B细胞来起作用。宿主细胞杀伤通过两种机制发生1 )补体依赖性 细胞毒性(CDC )途径和2 )抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC ) 途径。抗CD20抗体是遗传工程化的嵌合鼠/人单克隆抗体。该抗体是含 有鼠的轻链和重链可变区序列以及人恒定区序列的IgGl k免疫球蛋 白。抗CD20抗体由两条451个氨基酸的重4连和两条213个氨基酸的轻 链(#4居cDNA分析)组成，具有约145 kD的分子量。抗CD20抗体 对CD20抗原有大约8.0 nM的结合亲合性。嵌合的抗CD20抗体通过含有抗生素庆大霉素的营养培养基中的哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢)悬浮培养物产生。抗CD20抗体通过亲和层析和离子交换层析来纯化。 本专利技术涉及可结合CD20的抗体的构建、克隆、表达、纯化和生产。 该抗体将是靶向治疗剂，指明用于治疗患有复发的或难治的、低级的 或滤泡的、CD20阳性B细胞非何杰金淋巴瘤(NHL)的患者。专利技术概述本专利技术涉及编码多肽抗-CD20的核酸序列的转化。 根据本专利技术的一个方面，提供了编码抗-CD20分子的重链和轻链的核酸序列。根据本专利技术的另一方面，提供了由所述核酸序列编码的相应的氨基酸序列。本专利技术的特别的方面涉及抗-CD20分子的重链和轻链的可变区的从头合成。进一步公开的是，具有感兴趣的核酸序列的载体构建体的构建、所述载体构建体向感受态细菌中的转化、以及抗-CD20链向哺乳动物表达载体中的亚克隆。专利技术的详细il明抗CD20抗体是小鼠-人嵌合抗体。它由两条链组成l)轻链，其 由来自小鼠单克隆抗体2B8的轻链的可变区和人k恒定区组成；和2 ) 重链，其由来自小鼠单克隆抗体2B8的重链的可变区和人IgGl恒定区 组成。该抗体序列在专利WO94/11026中有描述。对于cDNA构建体的编码区的合成，遵循了从头开始的方法，因 为分泌抗CD20小鼠单克隆抗体的杂交瘤2B8在公众领域不是可获得 的。从头的基因合成还将允许针对用于蛋白表达的特定哺乳动物细胞 系的密码子优化。编码抗CD20抗体的轻链的核苷酸序列表示在SEQ ID 1中。编码抗CD20抗体的轻链的核苷酸序列的经密码子优化的版本表 示在SEQ ID2中。过程的一部分一皮改变，以确j呆在哺乳动物细月包系，例如CHO Kl和HEK 293中的最佳的重组蛋白表达。编码抗CD20抗体的重链的核苷酸序列 表示在SEQ ID 3中。编码抗CD20抗体的重链的核苷酸序列的经密码子优化的版本描 述在SEQ ID 4中。在抗CD20抗体重链的编码DNA序列中的密码子作为密码子优化 过程的一部分^皮改变，以确保在哺乳动物细l包系，例如CHOK1和HEK 293中的最佳的重组蛋白表达。表达载体的选择用于抗CD20抗体表达的哺乳动物表达载体的设本文档来自技高网...
【技术保护点】
制备具有体内生物学活性的抗ＣＤ２０单克隆抗体的方法，包括以下步骤： .抗ＣＤ２０单克隆抗体的轻链和重链的从头合成的步骤 .抗ＣＤ２０抗体的全长κ轻链的构建的步骤 .抗ＣＤ２０抗体的全长ＩｇＧ１重链的构建的步骤 .载体的构建步骤，所述载体包含编码抗－ＣＤ２０分子的轻多肽链和重多肽链的核酸序列。 .抗ＣＤ２０抗体链在哺乳动物表达载体中亚克隆以生产生物学活性抗体分子的步骤。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：V莫拉瓦拉帕特尔，
申请(专利权)人：阿维斯塔金格兰技术有限公司，
类型：发明
国别省市：IN[印度]
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