一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法技术

本发明专利技术公开了一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，以两种不同酶为对象，类弹性蛋白多肽纯化标签为基础，结合SpyTag/SpyCatcher自主粘合性，通过非色谱法分离纯化获得三臂拓扑结构的重组双酶，并实现双酶的固定化集成。本发明专利技术的方法利用ELPs的特有的温度敏感性，通过简单的离心即可得到高纯度的蛋白酶，并实现双酶的固定化集成。本发明专利技术操作简单，耗材少，设备要求低，容易生产。

Method for separating and purifying recombined double enzyme and integration

The invention discloses a recombinant enzyme purification and immobilization of the integrated method in two different enzymes as object, elastin like polypeptide purification tag based, combined with SpyTag/SpyCatcher self adhesion, get the topology of the group of three arm double enzyme purified by non chromatography separation, and immobilized double integration enzyme. The method of the invention utilizes the unique temperature sensitivity of the ELPs to obtain the high-purity protease through simple centrifugation, and realizes the integration of the immobilized enzyme. The invention has the advantages of simple operation, less material consumption, low equipment requirement and easy production.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化工
，具体涉及一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法。
技术介绍
多酶固定化技术是指将不同酶固定在同一载体上或将不同酶通过交联的方式形成多酶聚集体的一种技术。固定化多酶具有稳定性高、可重复利用、可提高反应的局部浓度从而提高产品收率的特点因而受到广泛关注。同时，固定化多酶在生物传感器、食品加工、生物医学等方面都具有很大的应用前景。传统的多酶固定化方法操作繁琐，过程不够温和，酶分离纯化及固定化需分步进行。传统的纯化程序相对复杂，耗时长，对设备要求较高，材料消耗大等直接导致了酶分离成本居高不下。据了解蛋白质的分离纯化的成本约占了总成本的60％～70％。如此高额的成本，严重影响蛋白酶固定化的广泛应用。过高的产品成本，使得产品市场竞争力不足。因此，寻找合适的材料，发展新型的分离纯化技术和固定化制备工艺是降低多酶固定化制备成本的必由之路。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，该方法以两种不同酶为对象，类弹性蛋白多肽(ELPs)纯化标签为基础，结合SpyTag/SpyCatcher自主粘合性，通过非色谱法分离纯化获得三臂拓扑结构的重组双酶，并实现双酶的固定化集成。具体包括：1)选择一对待重组的酶A与酶B，将编码酶A的基因序列a与编码酶B的基因序列b分别拼接到SpyTag基因序列的5’端和3’端，然后将得到的重组基因序列a-SpyTag-b克隆到第一表达载体上，构建得到第一重组蛋白表达载体；另构建带有SpyCatcher基因序列和ELPs基因序列的第二重组蛋白表达载体；将该第一重组蛋白表达载体和第二重组蛋白表达载体分别导入第一宿主细胞和第二宿主细胞，分别诱导高效表达；2)对导入了第二重组蛋白表达载体的第二宿主细胞的表达产物进行纯化处理：通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变，从而分离纯化得到重组蛋白SpyCatcher-ELPs；3)将步骤2)得到的重组蛋白SpyCatcher-ELPs与导入了第一重组蛋白表达载体的第一宿主细胞的表达产物相混合，重组蛋白SpyCatcher-ELPs中的SpyCatcher与该第一宿主细胞表达产物中重组双酶-SpyTag化合物的SpyTag自主粘合，形成重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物；然后通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变，从而纯化得到呈三臂拓扑结构的重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物，并同时实现该重组双酶的固定化集成。其中，所述步骤1)中，构建第二重组蛋白表达载体可以通过拼接SpyCatcher基因序列和ELPs基因序列，然后将得到的重组基因序列SpyCatcher-ELPs克隆到第二表达载体上来构建得到第二重组蛋白表达载体。或者也可以直接利用SpyCatcher基因序列和pET-22b-ELPs构建得到，该pET-22b-ELPs已进行菌种专利保藏(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO.4185，保藏日期：2010年9月17日)，并已申请专利(专利申请号：201010562100.5)。SpyTag的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述SpyCatcher的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术采用的SpyTag基因和SpyCatcher基因，在各自氨基酸序列的基础上，根据宿主大肠杆菌对密码子的偏好性，对基因序列进行密码子优化，例如，SpyTag的基因序列如SEQIDNo.3所示，SpyCatcher的基因序列如SEQIDNo.4所示(其中7-363位为编码序列)。所述基因拼接采用限制性内切酶NdeI、EcoRI、HindIII中的一种或多种，利用该些限制性内切酶将目的基因插入到表达载体中，并在宿主细胞中高效诱导表达。进一步优选地，所述第一表达载体、第二表达载体为质粒pET-22b(+)。进一步优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)或BLR。一实施例中：所述步骤1)中，诱导高效表达的方法为：将导入了第一重组蛋白表达载体的第一宿主细胞或导入了第二重组蛋白表达载体的第二宿主细胞按1:100的体积比接入到含100mg/L氨苄青霉素Amp的LB液体基中，OD600值为0.6～1.0，37℃、200rpm下恒温培养10～12h；然后按1:100的接种量接种于TB培养基中，置于37℃摇床、200rpm下恒温培养3～4小时，至OD600值达到0.6～0.8；然后加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂并使其终浓度为0.5mM，20℃、200rpm下恒温培养24h，即可诱导基因高效过量表达。一实施例中：所述步骤2)包括：2-1)对第二宿主细胞高效表达后得到的菌液在4℃下10000rpm离心10min，收集菌体，按照1L菌液：20mLPBS缓冲液的比例用PBS缓冲液重悬菌体；超声破碎PBS重悬的菌体，功率为300W，工作2s间隙4s，循环次数为80次，之后高速冷冻离心，收集细胞破碎液的上清液，即细胞粗提液；2-2)在1～4mol/L的盐离子浓度条件下，通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变：将2-1)得到的细胞粗提液在38℃恒温水浴20min后，38℃下12000rpm离心10min，去上清液；2-3)沉淀物加入4℃预冷的PBS缓冲液，反复吹打，充分混匀，冰浴15min，4℃下12000rpm离心10min，取上清液；2-4)根据需要重复步骤2-2)和2-3)，最终弃沉淀物，收集上清液，即为纯化的重组蛋白SpyCatcher-ELPs溶液。6.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述步骤3)包括：3-1)对第一宿主细胞高效表达后得到的菌液在4℃下10000rpm离心10min，收集菌体，按照1L菌液:20mLPBS缓冲液的比例用PBS缓冲液重悬菌体；超声破碎PBS重悬的菌体，功率为300W，工作2s间隙4s，循环次数为80次，之后高速冷冻离心，收集细胞破碎液的上清液，即细胞粗提液；3-2)将该细胞粗提液与纯化的重组蛋白SpyCatcher-ELPs混合，37℃反应3h，重组蛋白SpyCatcher-ELPs中的SpyCatcher与该上清液中重组双酶-SpyTag化合物的SpyTag自主粘合，形成重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物；3-3)在1～4mol/L的盐离子浓度条件下，通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变：将3-2)得到的溶液在38℃恒温水浴20min后，38℃下12000rpm离心10min，去上清液；3-4)沉淀物加入4℃预冷的PBS缓冲液，反复吹打，充分混匀，冰浴15min，4℃下12000rpm离心10min，取上清液；3-5)根据需要重复步骤3-3)和3-4)，最终同时收集上清液和沉淀物，上清即为纯化的三臂拓扑结构的重组双酶，不可溶沉淀物即为固定化的重组双酶。一实施例中：所述盐离子由盐溶液提供，该盐溶液的盐为氯化钠、碳酸钠、硫酸钠、硝酸钠、氯化钾、碳酸钾、硫酸钾、硝酸钾、氯化铵、硫酸铵和硝酸铵中的任意一种。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：包括：1)选择一对待重组的酶A与酶B，将编码酶A的基因序列a与编码酶B的基因序列b分别拼接到SpyTag基因序列的5’端和3’端，然后利用得到的重组基因序列a‑SpyTag‑b构建得到第一重组蛋白表达载体；另构建带有SpyCatcher基因序列和ELPs基因序列的第二重组蛋白表达载体；将该第一重组蛋白表达载体和第二重组蛋白表达载体分别导入第一宿主细胞和第二宿主细胞，分别诱导高效表达；2)对导入了第二重组蛋白表达载体的第二宿主细胞的表达产物进行纯化处理：通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变，从而分离纯化得到重组蛋白SpyCatcher‑ELPs；3)将步骤2)得到的重组蛋白SpyCatcher‑ELPs与导入了第一重组蛋白表达载体的第一宿主细胞的表达产物相混合，重组蛋白SpyCatcher‑ELPs中的SpyCatcher与该第一宿主细胞表达产物中重组双酶‑SpyTag化合物的SpyTag自主粘合，形成重组双酶‑SpyTag‑SpyCatcher‑ELPs化合物；然后通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变，从而纯化得到呈三臂拓扑结构的重组双酶‑SpyTag‑SpyCatcher‑ELPs化合物，并同时实现该重组双酶的固定化集成。...

【技术特征摘要】
1.一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：包括：1)选择一对待重组的酶A与酶B，将编码酶A的基因序列a与编码酶B的基因序列b分别拼接到SpyTag基因序列的5’端和3’端，然后利用得到的重组基因序列a-SpyTag-b构建得到第一重组蛋白表达载体；另构建带有SpyCatcher基因序列和ELPs基因序列的第二重组蛋白表达载体；将该第一重组蛋白表达载体和第二重组蛋白表达载体分别导入第一宿主细胞和第二宿主细胞，分别诱导高效表达；2)对导入了第二重组蛋白表达载体的第二宿主细胞的表达产物进行纯化处理：通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变，从而分离纯化得到重组蛋白SpyCatcher-ELPs；3)将步骤2)得到的重组蛋白SpyCatcher-ELPs与导入了第一重组蛋白表达载体的第一宿主细胞的表达产物相混合，重组蛋白SpyCatcher-ELPs中的SpyCatcher与该第一宿主细胞表达产物中重组双酶-SpyTag化合物的SpyTag自主粘合，形成重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物；然后通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变，从而纯化得到呈三臂拓扑结构的重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物，并同时实现该重组双酶的固定化集成。2.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述第二重组蛋白表达载体通过SpyCatcher基因序列和pET-22b-ELPs构建得到。3.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述SpyTag的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述SpyCatcher的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。4.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述步骤1)中，诱导高效表达的方法为：将导入了第一重组蛋白表达载体的第一宿主细胞或导入了第二重组蛋白表达载体的第二宿主细胞按1:100的体积比接入到含氨苄青霉素的LB液体基中，OD600值为0.6～1.0，37℃、200rpm下恒温培养10～12h；然后按1:100的接种量接种于TB培养基中，37℃、200rpm下恒温培养3～4h，至OD600值达到0.6～0.8；然后加入IPTG诱导剂使其终浓度为0.5mM，20℃、200rpm下恒温培养24h，即可诱导基因过量表达。5.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述步骤2)包括：2-1)对第二宿主细胞高效表达后得到的菌液离心，收集菌体，按...

【专利技术属性】
技术研发人员：张光亚，王金丹，林源清，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：福建;35