本发明专利技术涉及一种rhIL-12工程细胞大规模无血清培养方法。本发明专利技术提供了一种rhIL-12工程细胞大规模无血清培养方法，包括下述步骤：将处于对数生长期的rhIL-12工程细胞接种于无血清无蛋白培养基中培养，所述培养基为含有终浓度分别为0.8-1.2mM的丙酮酸钠、0.075-0.125mM的次黄嘌呤、0.012-0.020mM的胸腺嘧啶脱氧核苷、0.5-0.9mg/L的腺嘌呤核苷、0.5-0.9mg/L的鸟嘌呤核苷、0.5-0.9mg/L的胞嘧啶核苷、0.5-0.9mg/L的尿嘧啶核苷、0.4-0.8mg/L的L-谷氨酰胺、0.4-0.8mg/L的L-天冬酰胺、1.5-2.0mg/L的L-脯氨酸、0.08-0.125mM的非必需氨基酸的CD?CHO液体培养基。本发明专利技术还提供在本发明专利技术的方法中使用的培养基。利用本发明专利技术的培养基和培养方法可获得高产量、高活性的重组人白细胞介素-12。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，涉及细胞培养基和培养方法。具体而言，本专利技术为一种利用无血清无蛋白培养基对重组人白细胞介素-12工程细胞进行大规模培养的方法，利用该方法培养重组人白细胞介素-12工程细胞，可获得高产量、高活性的重组人白细胞介素-12。
技术介绍
人白细胞介素-12 (Human Interleukin 12，hIL-12)是一种异二聚体细胞因子，由 P35和p40两个亚单位通过多对二硫键连接组成。hIL-12又称为NK细胞刺激因子(NKSF)， 具有强烈的抗肿瘤和抗病毒效益，这种效应是由机体的自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK细胞)介导的，hIL-12还在细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、B细胞的发育分化和成熟活化中起重要作用，被誉为免疫系统行使抗病毒、抗肿瘤的核心调控因子，机体天然免疫系统的关键蛋白质。这一系列的生物学功能使人们认识到hIL-12有可能在临床应用中发挥重要作用。目前，重组人白细胞介素-12 (Recombinant Human Interleukin 12， rhIL-12)作为一种药物已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病和过敏性哮喘的临床试验阶段，但其规模化生产仍存在一定的困难。因此，通过体外培养获得高产量、高活性的rhIL-12已成为亟需解决的问题。由于IL-12结构的复杂性，使其无法在E. coli中获得表达，必须采用真核表达体系来获取重组蛋白。IL-12(p70)分子是由p40和p35两个不同的亚基组成的异二聚体分子，P40和p35两个亚基分别由两个染色体上两个不同的基因编码，只有在同一细胞内同时产生才能得到有生物学活性的二聚体。P40和p35两个亚基的天然表达严重不平衡，胞浆中P40的生成大于p35，分泌的p40易于形成二聚体，对IL-12的活性有抑制作用。由于两条链在胞内的不平衡表达，从而很难获取高表达rhIL-12的工程细胞株。此外， rhIL-12在制备过程中极易失活，导致回收率极低，从而限制了产量。目前，用于真核表达的细胞主要有酵母细胞、COS细胞、昆虫细胞、CHO细胞。前三者因较难直接分泌重组蛋白或不能持续表达蛋白产物或培养成本较高，实际应用中难以获得大量产品。CHO细胞表达体系， 避免了上述体系的不足，外源蛋白易于分泌到培养基中，能正确组装多亚基蛋白，外源基因整合稳定，能完成翻译后修饰，能以悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养规模易于放大，已成为表达外源基因的最佳宿主之一。因此，CHO细胞成为rhIL-12生产的首选载体。综合上述原因，经过几年的努力，我们成功建立了高效表达rhIL-12蛋白的重组CHO细胞(rhIL-12工程细胞)，获得了国家专利技术专利(中国专利号zl.03131567.4)，为rhIL-12 工程细胞大规模培养方法的建立奠定了基础。无血清培养基为不含人或动物血清的培养基，但可能包含个别蛋白或大量蛋白组分，主要用于一些需要在无血清条件下生长的特殊类型的细胞及用于蛋白质生产的工程细胞的培养。无血清培养基是工程细胞培养的重要工具，使细胞培养在一套限定的条件下进行，避免了血清中复杂成分对后续研究及临床使用的干扰及影响。使用无血清培养基对工程细胞进行培养具有以下优点(1).增加产物的确定性；( .产物性能更加一致；C3).容易进行纯化和下游加工；(4).细胞功能的精确评估；( .增强生长和/或产量；(6).生理反应性的较好对照；(7).增强细胞内中介物的检测。重组细胞的培养是基因工程药物研究与开发的主要环节之一。研究人员一直致力于建立易于操作、产量高、产物活性高、成本低的工程细胞大规模培养的方法，其中生物反应器在大规模培养中占重要地位。生物反应器按细胞培养方式不同可分为三类悬浮培养用生物反应器、贴壁培养用生物反应器、包埋培养用生物反应器。悬浮培养用生物反应器不需要使用微载体，细胞在反应器中不贴壁，悬浮于细胞培养液中生长，如搅拌反应器、中空纤维反应器、气升式反应器等。贴壁培养用生物反应器需要使用微载体，微载体悬浮于反应器的细胞培养液中，细胞贴附在微载体上生长， 如搅拌反应器(微载体培养)、中空纤维反应器等。包埋培养用生物反应器使用多孔载体或微囊，细胞被截留在载体中或包埋于微囊中，如流化床反应器、固化床反应器。美国NBS (New Brunswick Scientific Co.，inc)公司产生的生物反应器就是一种包埋培养用生物反应器，其优点在于能最大程度降低搅拌剪切力对细胞的伤害，细胞容易培养生长，既可以用于贴壁细胞培养，又可用于悬浮细胞培养。为了减少临床应用风险以及便于下游纯化过程考虑，我们将rhIL-12工程细胞在含10%血清的培养基中培养，逐渐减少培养基中的血清含量，最后到无血清培养，进行了多种探索，最终选定了 CD CHO无血清培养基作为生产用培养基，rhIL-12工程细胞能够在限定化学成分的⑶CHO无血清培养基中生长并高分泌IL-12，建立了工程细胞的三级种子库并经中国药品生物制品检定所复检合格(报告编号SH201000431)。同时我们探索了 rhIL-12工程细胞从静止培养放大到发酵罐规模培养的方法，建立了 rhIL-12工程细胞株大规模无血清培养的工艺流程。在本专利技术之前，一些研究人员分别进行了将P40和p35的基因分别插入同一种载体进行共转染(戴燕，陈慰峰.人重组白细胞介素12在CHO细胞中的表达.生物化学与生物物理进展，1998，25 (3) =254-258)，或将p40和p35的基因融合构建IL-12单链真核表达载体进行表达(张梅，司履生，金莉等.重组人单链白细胞介素12 融合基因的构建、真核表达及生物学活性测定.中华血液学杂志，2000，21 (12) =636-640), 或将转染了 hIL-12的载体细胞的进行常规培养(刘锰，郑珊珊.重组人细胞介素12基因在CH0-dhfr_细胞的稳定表达.免疫学杂志，1996，12 (4) :215-219)，但均未能实现载体细胞在大规模的无血清培养情况下高效表达rhIL-12。应用本专利技术所建立的工艺对rhIL-12 工程细胞进行大规模培养，无血清培养上清经Wfestern blot鉴定，在40kD和35kD处出现表达条带。无血清培养上清具有促进NKG细胞产生IFN-γ的能力，与国际标准品相比较其活性在(4-6) X106IU/mg之间，rhIL-12(p70)的含量可达到5mg/L以上，可以连续灌流60 天。以2台7.5L发酵罐同时工作计算，每月可生产约含3000mg rhIL_12(p70)蛋白的无血清培养上清，可满足工业化生产的要求。
技术实现思路
因此，本专利技术提供了筛选rhIL-12工程细胞的加压培养基、生产用无血清无蛋白培养基及稳定的rhIL-12工程细胞株大规模培养工艺。具体而言，本专利技术一方面提供，包括下述步骤将处于对数生长期的rhIL-12工程细胞接种于无血清无蛋白培养基中培养，所述培养基为含有终浓度分别为0. 8-1. 2mM的丙酮酸钠、0. 075-0. 125mM的次黄嘌呤、 0. 012-0. 020mM的胸腺嘧啶脱氧核苷、0. 5-0. 9mg/L的腺嘌呤核苷、0. 5-0. 9mg/L的鸟嘌呤核苷、0. 5-0. 9mg/L的胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种ｒｈＩＬ－１２工程细胞大规模无血清培养方法，包括下述步骤：将处于对数生长期的ｒｈＩＬ－１２工程细胞接种于无血清无蛋白培养基中培养，所述培养基为含有终浓度分别为０．８－１．２ｍＭ的丙酮酸钠、０．０７５－０．１２５ｍＭ的次黄嘌呤、０．０１２－０．０２０ｍＭ的胸腺嘧啶脱氧核苷、０．５－０．９ｍｇ／Ｌ的腺嘌呤核苷、０．５－０．９ｍｇ／Ｌ的鸟嘌呤核苷、０．５－０．９ｍｇ／Ｌ的胞嘧啶核苷、０．５－０．９ｍｇ／Ｌ的尿嘧啶核苷、０．４－０．８ｍｇ／Ｌ的Ｌ－谷氨酰胺、０．４－０．８ｍｇ／Ｌ的Ｌ－天冬酰胺、１．５－２．０ｍｇ／Ｌ的Ｌ－脯氨酸、０．０８－０．１２５ｍＭ的非必需氨基酸的ＣＤ ＣＨＯ液体培养基。
【技术特征摘要】
1.一种rhIL-12工程细胞大规模无血清培养方法，包括下述步骤将处于对数生长期的rhIL-12工程细胞接种于无血清无蛋白培养基中培养，所述培养基为含有终浓度分别为0. 8-1. 2mM的丙酮酸钠、0. 075-0. 125mM的次黄嘌呤、 0. 012-0. 020mM的胸腺嘧啶脱氧核苷、0. 5-0. 9mg/L的腺嘌呤核苷、0. 5-0. 9mg/L的鸟嘌呤核苷、0. 5-0. 9mg/L的胞嘧啶核苷、0. 5-0. 9mg/L的尿嘧啶核苷、0. 4-0. 8mg/L的L-谷氨酰胺、0. 4-0. 8mg/L的L-天冬酰胺、1. 5-2. Omg/L的L-脯氨酸、0. 08-0. 125mM的非必需氨基酸的⑶CHO液体培养基。2.根据权利要求1所述的rhIL-12工程细胞大规模无血清培养方法，其中所述培养在发酵罐中进行。3.根据权利要求1或2所述的rhIL-12工程细胞大规模无血清培养方法，其中维持所述培养基中的残糖浓度为lOmmol/L。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的rhIL-12工程细胞大规模无血清培养方法，其中维持所述培养基中的残糖浓度在lOmmol/L以上，并且控制乳酸浓度在20mmol/L以下。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的rhIL-12工程细胞大规模无血清培养方法， 其中所述rhIL-12工程细胞通过加压培养基筛选获得，所述加压培养基为含有终浓度分别为1. OmM的丙酮酸钠、0. ImM的次黄嘌呤、0. 016mM的胸腺嘧啶脱氧核苷、0. 7mg/L的腺嘌呤核苷、0. 7mg/L的鸟嘌呤核苷、0. ...
【专利技术属性】
技术研发人员：田志刚，程民，魏海明，郑晓东，孙汭，费保珍，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34
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