用于冷冻保存免疫细胞的组合物和方法技术

本文提供了通过在冷冻前用PTD

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于冷冻保存免疫细胞的组合物和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年4月8日提交的美国临时专利申请第62/830,950号的优先权的权益，其全部内容通过引用并入本文。


[0003]本技术涉及通过在冷冻前用PTD
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MYC融合蛋白(例如，HIV TAT
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MYC融合多肽)预处理细胞来冷冻保存免疫细胞，如外周血单核细胞(PBMC)的组合物和方法。本文还提供了用于实施所述方法的试剂盒。

技术介绍

[0004]冷冻保存是一种通过将细胞冷却至低的温度而对细胞进行保存的过程。在这些低的温度下，生物活性(包括在正常条件下会导致细胞死亡的生化反应)被有效地阻止。然而，如果控制不当，冷冻保存可以导致细胞损伤和细胞存活率的下降。此外，在冷冻
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解冻过程之后，通常需要培养细胞以确保适当的恢复。目前，对于在冷冻保存的细胞已经被解冻后增加细胞存活率和恢复的冷冻保存方法存在未满足的需求。

技术实现思路

[0005]在一个方面中，本公开提供了一种冷冻组合物，其包括：(a)MYC融合多肽，所述MYC融合多肽包含(i)蛋白质转导结构域，(ii)MYC多肽序列；和(b)从供体受试者分离的一或多种外周血单核细胞(PBMC)，其中与从受试者分离的对照PBMC细胞相比，所述组合物表现出增加的细胞存活率。在一些实施例中，蛋白质转导结构域序列是TAT蛋白质转导结构域序列。在一些实施例中，蛋白质转导结构域是TAT
[48
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>57]。在一些实施例中，蛋白质转导结构域是TAT
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48]。在一些实施例中，MYC融合多肽包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述一或多种外周血单核细胞包含T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、粒细胞、巨噬细胞或其任意组合。在一些实施例中，组合物进一步包括细胞悬浮液培养基。在一些实施例中，细胞悬浮液培养基包含CHB培养基、CS5培养基或CS10培养基。在一些实施例中，在冷冻
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解冻循环后与不存在MYC融合多肽的对照PBMC相比，所述组合物在解冻时表现出增加的细胞恢复。在一些实施例中，在冷冻
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解冻循环后与不存在MYC融合多肽的对照PBMC相比，所述组合物在细胞活化后表现出增加的CD25表达。在一些实施例中，本公开提供了一种包含冷冻组合物的免疫细胞库。
[0006]在一个方面中，本公开提供了一种冷冻保存外周血单核细胞(PBMC)的方法，所述方法包括(a)使包含从供体受试者分离的一或多种PBMC的组合物与有效量的MYC融合多肽接触，所述MYC融合多肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列；和(b)将PBMC冷却到足以冷冻所述组合物的温度。在一些实施例中，蛋白质转导结构域序列是TAT蛋白质转导结构域序列。在一些实施例中，蛋白质转导结构域是TAT
[48
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57]。在一些实施例中，蛋白质转导结构域是TAT
[57
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48]。在一些实施例中，MYC融合多肽包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所
述一或多种外周血单核细胞包含T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、粒细胞或其任意组合。在一些实施例中，所述方法进一步包括将PBMC悬浮在细胞悬浮液培养基中。在一些实施例中，细胞悬浮液培养基包含CHB培养基、CS5培养基或CS10培养基。
[0007]在一些实施例中，使包含一或多种PBMC的组合物与浓度为约0.5μg/mL至约500μg/mL的MYC融合多肽接触。在一些实施例中，使包含一或多种PBMC的组合物与浓度为约0.5μg/mL至约10μg/mL的MYC融合多肽接触。在一些实施例中，在步骤(b)之前，使包含一或多种PBMC的组合物与MYC融合多肽接触少于24小时。在一些实施例中，在步骤(b)之前，使包含一或多种PBMC的组合物与MYC融合多肽接触约1小时。在一些实施例中，在步骤(a)之后且在步骤(b)之前，洗涤PBMC。
[0008]在一些实施例中，使用受控速率低温冷冻机冷却PBMC。在一些实施例中，以约
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1℃/分钟的速率冷却PBMC。在一些实施例中，足以冷冻组合物的温度为约
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80℃至约
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190℃。
[0009]在一些实施例中，所述方法进一步包括解冻所述冷冻保存的细胞，使得与不与有效量的MYC融合多肽接触的对照PBMC相比，所述细胞表现出增加的细胞存活率、增加的细胞恢复、细胞活化或在细胞活化后增加的CD25表达中的一或多种。
[0010]本文还提供了使用已使用MYC融合多肽冷冻保存的细胞的方法。
[0011]本文还提供了试剂盒，所述试剂盒包含本文所述任何实施例的本技术的MYC融合多肽、MYC融合多肽修饰的免疫细胞和/或冷冻组合物和使用说明书。
[0012]在一个方面中，本公开提供了一种免疫细胞库，其包含：(a)MYC融合多肽，所述MYC融合多肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列；和(b)从供体受试者分离的一或多种外周血单核细胞(PBMC)。
附图说明
[0013]图1示出了在用PTD
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MYC融合多肽(TBX
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3400)或媒介物对照(PBMC)预处理、在各种条件下冷冻保存和解冻之后，免疫细胞(例如外周血单核细胞(PBMC))的细胞存活率。用7
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氨基放线菌素D(7
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AAD)或台盼蓝对细胞进行染色，并经由流式细胞术或血细胞计数器进行分析，以确定解冻后活细胞的范围。如所指示的，将细胞冷冻在CHB培养基、CS5培养基或CS10培养基中，并且冷冻在VIA Freeze
TM
受控速率冷冻机的容器中。
[0014]图2示出了在用PTD
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MYC融合多肽预处理、在各种条件下冷冻保存和解冻之后免疫细胞(PBMC)的细胞恢复(％)。如所指示的，将细胞冷冻在CHB培养基、CS5培养基或CS10培养基中，并且冷冻在容器中。
[0015]图3示出了在用PTD
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MYC融合多肽或媒介物对照进行预处理、在各种条件下冷冻保存和解冻之后，恢复的从供体受试者分离的免疫细胞(T细胞、B细胞、单核细胞、粒细胞和NK细胞)的细胞群的相对量。如所指示的，将细胞冷冻在CHB培养基、CS5培养基或CS10培养基中，并且冷冻在VIA Freeze
TM
受控速率冷冻机的容器中。通过流式细胞术和各种细胞群的免疫表型分型测定细胞群。
[0016]图4示出了在用PTD
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MYC融合多肽或媒介物对照进行预处理、在各种条件下冷冻保存和解冻之后，对照细胞和免疫细胞的细胞活化，其被表达为CD25表达的中位荧光强度(中位FI)。如所指示的，将细胞冷冻在CHB培养基、CS5培养基或CS10培养基中，并且冷冻在VIA Freeze...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种冷冻组合物，其包含：(a)MYC融合多肽，所述MYC融合多肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列；和(b)从供体受试者分离的一或多种外周血单核细胞(PBMC)；其中与从所述受试者分离的对照PBMC细胞相比，所述组合物表现出增加的细胞存活率。2.根据权利要求1所述的冷冻组合物，其中蛋白质转导结构域序列是TAT蛋白质转导结构域序列。3.根据权利要求1或权利要求2所述的冷冻组合物，其中所述MYC融合多肽包含SEQID NO:1。4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的冷冻组合物，其中所述一或多种外周血单核细胞包含T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、粒细胞、巨噬细胞或其任何组合。5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的冷冻组合物，其进一步包含细胞悬浮液培养基。6.根据权利要求5所述的冷冻组合物，其中所述细胞悬浮液培养基包含CHB培养基、CS5培养基或CS10培养基。7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的冷冻组合物，其中在冷冻
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解冻循环后，与不存在所述MYC融合多肽的对照PBMC相比，所述组合物在解冻时表现出增加的细胞恢复。8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的冷冻组合物，其中在冷冻
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解冻循环后，与不存在所述MYC融合多肽的对照PBMC相比，所述组合物在细胞活化后表现出增加的CD25表达。9.一种冷冻保存外周血单核细胞(PBMC)的方法，其包含：(a)使包含从供体受试者分离的一或多种PBMC的组合物与有效量的MYC融合多肽接触，所述MYC融合多肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列；以及(b)将所述PBMC冷却至足以冷冻所述组合物的温度。10.根据权利要求9所述的方法，其中蛋白质转导结构域序列是TAT蛋白质转导结构域序列。11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述MYC融合多肽包含SEQ IDNO:1。12.根据权利要求9至11中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种外周血单核细胞包含T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、粒细胞或其任何组合。13.根据权利要求9至12中任一权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y，
申请(专利权)人：泰加生物工艺学公司，
类型：发明
国别省市：