吡咯伯克霍尔德氏菌的应用及其产脂肪酶的方法技术

本发明专利技术涉及吡咯伯克霍尔德氏菌的应用及其产脂肪酶的方法，属于环境微生物应用领域。本发明专利技术的咯伯克霍尔德氏菌B1213的用途为产脂肪酶；咯伯克霍尔德氏菌B1213培养液，优化后的脂肪酶活为180‑250U/mL；所述咯伯克霍尔德氏菌B1213保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12806；保藏时间为2016年7月21日。本发明专利技术采用咯伯克霍尔德氏菌B1213产脂肪酶的方法，对吡咯伯克霍尔德氏菌B1213进行培养即可。与本发明专利技术之前细菌、真菌产脂肪酶的方法相比，本发明专利技术产脂肪酶的方法，在菌种来源上具有新意，所产脂肪酶活性高，生产周期短，操作简单。

Application of pyrrole Burke's bacillus and method for producing lipase by using the method of the preparation of pyrrole and its application to the production of lipase by using the method of the preparation of

The present invention relates to the application of pyrrole Burke's bacillus and its lipase production method, which belongs to the field of environmental microorganism application. The use of Holder's B1213, Burke bacteria of the present invention for lipase production; slightly Burke Holder's bacteria cultured in B1213, after the optimization of lipase activity was 180 250U/mL; the Burke, Holder's B1213 strains preserved in general microbial culture collection center China Management Committee; the preservation number is CGMCCNo.12806; the preservation time is July 21, 2016. The present invention adopts the method of producing lipase by Burke B1213, and can be used for culturing pyrrole and Bacillus B1213. Compared with the prior method for producing lipase by bacteria and fungi, the lipase producing method of the invention has the advantages of high activity, short production period and simple operation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及吡咯伯克霍尔德氏菌的应用及其产脂肪酶的方法，属于环境微生物应用领域。
技术介绍
脂肪酶( EC 3.1.1.3) 又称三酰甘油酰基水解酶。在传统酶学中, 脂肪酶是一类水解长链脂肪酸甘油酯生成游离脂肪酸和甘油的界面酶。1984 年，Zaks 和 Klibanov在有机溶剂体系中,用脂肪酶成功地催化合成了一系列有机化合物[1]。该研究揭开了非水相酶学的研究序幕, 并迅速发展为应用酶学研究中最为活跃、发展最为迅速的领域。脂肪酶作为非水相酶学中最为重要的一类酶，具有良好的酯化、转酯、醇解和胺解等特性[2]。作为重要的工业用酶, 广泛应用于食品、饲料、制革、洗涤、油酯化工等传统工业领域。现在脂肪酶被广泛地应用于生物柴油制备、手型药物拆分等应用前景广阔的领域。脂肪酶在食品工业上的应用最早且最为广泛，例如脂肪酶水解生成的短链脂肪酸可用于增加食品本身的风味、香味和质构。在面类食品的生产中，将脂肪酶加入面粉中进行发酵，发现不仅面团的弹性明显提高，而且做成产品的感官品质也得到了增强。脂肪酶在乳制品中的作用非常重要，水解后的乳脂增加了新的风味物质如甲酯酮类，风味酯类等，而且产生的脂肪酸更能赋予乳制品的独有风味。脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中，而微生物脂肪酶种类最多。微生物脂肪酶广泛存在于细菌、酵母和霉菌中，具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度适应性和底物特异性，因此微生物产脂肪酶是大规模生产脂肪酶的主要途径。目前，已知大约有2%的微生物产脂肪酶，至少包括 65个属的微生物，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，且不同微生物来源的脂肪酶其组成成分、理化特性各不相同。细菌脂肪酶在大规模商业化生产中扮演着重要角色。细菌脂肪酶大多数是胞外酶易于液体深层发酵，生产比较容易。细菌脂肪酶大多数是碱性脂肪酶，且在 pH 4~11、温度 30℃~60℃间具有良好的稳定性。吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia），其应用主要在促进植物生长和植物病害的生物防治；目前还未有关于利用吡咯伯克霍尔德氏菌产脂肪酶的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够产脂肪酶的新菌株；及该菌株的应用和采用该菌株产脂肪酶的方法。技术方案本专利技术从土壤中筛选并分离出了一株新的菌株；是杆状的革兰氏阴性菌，不能形成芽孢。经鉴定，该菌株是一种吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）；命名为吡咯伯克霍尔德氏菌B1213；保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；保藏编号为CGMCC 12806；保藏时间为2016年7月21日。本专利技术的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213能够产脂肪酶，所产脂肪酶呈弱碱性。采用本专利技术的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213产脂肪酶的其中一种方法为：对吡咯伯克霍尔德氏菌B1213进行培养。另外，实验证明，在橄榄油存在的情况下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213产脂肪酶的能力明显提高。橄榄油作为诱导剂，在不添加橄榄油的情况下，产脂肪酶的量非常少。上述方法，优选的，在改良基础培养基存在的条件下，对吡咯伯克霍尔德氏菌B1213进行培养；所述改良基础培养基，由基础培养基和橄榄油按照100:1的体积比组成，121℃灭菌15min；所述基础培养基，每1L中含有的成分为：蔗糖0-12g、蛋白胨5-35g、硫酸铵1.0g、三水合磷酸钾1.0g、七水合硫酸镁0.5g、蒸馏水余量，pH7.0。其中，基础培养基中蔗糖含量、蛋白胨含量的变化，均会对脂肪酶产量（体现为培养液的酶活）产生影响；优选的，蔗糖含量为1-7g/L；所述蛋白胨为胰蛋白胨胰蛋白胨含量20-25g/L。具体的，将吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液接种于改良基础培养基，在150-200 rpm、30-35℃的条件下恒温震荡培养。上述方法，优选的，培养条件为转速180rpm，温度35℃。其他条件相同情况下，在此培养条件下，所获得培养液中脂肪酶的酶活更高；优化后酶活为180-250U/mL。上述方法，所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液是由吡咯伯克霍尔德氏菌B1213培养获得的。在获得吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的条件下，本领域技术人员通过常规操作即可以获得吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液。本专利技术中，对于某个成分的含量的百分比，如果没有特别说明，均指重量百分比（w/w）。本专利技术所用专业术语说明：rpm是转速单位，1 rpm是指每分钟旋转一转。有益效果：（1）首次分离培养出能够高产脂肪酶的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213；（2）吡咯伯克霍尔德氏菌B1213培养液，优化后的脂肪酶活为180-250U/mL；（3）与本专利技术之前细菌、真菌产脂肪酶相比，在菌种来源上具有新意；所产脂肪酶活性高，生产周期短，操作简单。保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年7月21日；保藏编号：CGMCCNo.12806；分类命名：吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）。附图说明图1为本专利技术中所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的显微镜下形态特征；图1中，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213为杆状的革兰氏阴性菌，且不能形成芽孢；图2为菌株B1213在罗丹明B平板上生成的显色圈；图2中：在菌体周围产生了红色的颜色圈，证明B1213菌分解橄榄油产生了脂肪酸；图3为吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的16SrDNA序列系统发育分析；图4为吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的recA序列系统发育树分析；图5 蔗糖添加量对B1213产脂肪酶的影响；图6胰蛋白胨添加量对B1213产脂肪酶的影响；图7 所产脂肪酶的硫酸铵分级沉淀曲线。具体实施方式下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1菌株B1213的鉴定菌株B1213分离自土壤，其形态如图1所示，属于杆状的革兰氏阴性菌，不能形成芽孢。提取其基因组DNA，并利用16s rDNA和BCR1引物对于该基因组DNA进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)数据库进行菌株比对。(1)16S rDNA 序列分析：16s rDNA正向引物27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,如SEQ ID NO.1所示；16s rDNA反向引物1492R：5'-ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3'，如SEQ ID NO.2所示；扩增所得16S rDNA序列如SEQ ID NO：3所示，序列全长为1411bp。将该扩增所得16S rDNA序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图3。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）B1213的一种用途，用于产脂肪酶；所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12806；保藏时间为2016年7月21日。

【技术特征摘要】
1.吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）B1213的一种用途，用于产脂肪酶；所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12806；保藏时间为2016年7月21日。2.一种采用权利要求1所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213产脂肪酶的方法：对吡咯伯克霍尔德氏菌B1213进行培养。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在橄榄油存在的情况下，对吡咯伯克霍尔德氏菌B1213进行培养。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在改良基础培养基存在的条件下，对吡咯伯克霍尔德氏菌B1213进行培养；所述改良基础培养基，由基础培养基和橄榄油按...

【专利技术属性】
技术研发人员：郦金龙，李秀婷，朱运平，滕超，熊科，申卫家，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：北京;11