吡咯伯克霍尔德氏菌的应用及其降解萘的方法技术

本发明专利技术涉及吡咯伯克霍尔德氏菌的应用及其降解萘的方法，属于环境微生物应用领域。本发明专利技术的咯伯克霍尔德氏菌B1213的用途为降解NAP；对NAP的降解率可高达92.45%‑96.89%；所述咯伯克霍尔德氏菌B1213保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12806；保藏时间为2016年7月21日。本发明专利技术采用咯伯克霍尔德氏菌B1213降解NAP的方法，是在酵母提取物存在的条件下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213与NAP接触。与本发明专利技术之前细菌、真菌降解萘的方法相比，本发明专利技术降解萘的方法，在菌种来源上具有新意，其对萘的降解率较高，降解周期短，操作简单。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及吡咯伯克霍尔德氏菌的应用及其降解萘的方法，属于环境微生物应用领域。
技术介绍
萘(naphthalene,NAP)是环境中普遍存在的具有代表性的一类重要持久性有机污染物(persistentorganicpollutants，POPs)。大量研究已经证明，NAP具有慢性毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”作用，是环境中一类危险而且需重点研究的、也是各国优先控制的污染物。由于大气沉降、污水灌溉、固体废弃物填埋渗漏、油田开采和石油产品大量使用等，造成全球范围内地方土壤NAP污染，在我国许多地方已出现较严重污染的情况。NAP由于性质稳定、难于降解，在土壤环境中呈不断积累的趋势，严重危害着土壤的生产和生态功能、农产品质量和人类健康。目前，治理土壤NAP污染的方法主要有物理修复、化学修复和生物修复。其中生物修复技术因具有成本低、无二次污染、可大面积应用等独特优点而越来越受到人们的重视，是目前最具潜力的土壤修复技术之一。吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderiapyrrocinia），其应用主要在促进植物生长和植物病害的生物防治；目前未见有关利用吡咯伯克霍尔德氏菌降解NAP的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够降解萘的新菌株；及该菌株的应用和采用该菌株降解NAP的方法。技术方案本专利技术从土壤中筛选并分离出了一株新的菌株；属于杆状的革兰氏阴性菌，不能形成芽孢；经鉴定，该菌株是一种吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderiapyrrocinia）；命名为吡咯伯克霍尔德氏菌B1213；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号：CGMCCNo.12806；保藏日期：2016年7月21日。本专利技术的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213能够降解NAP；吡咯伯克霍尔德氏菌B1213对NAP的降解率可高达92.45%-96.89%。采用本专利技术的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213降解NAP的其中一种方法为：在酵母提取物存在的条件下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213与NAP接触。其中，酵母提取物的量会影响降解率。所以，上述方法，优选的，在改良BSM基础盐液体培养基存在的条件下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213与NAP接触；所述改良BSM基础盐液体培养基，每1L中含有以下成分：酵母提取物2-10g，硫酸铵0.5g，氯化钠4.0g，三水合磷酸钾0.5g，七水合硫酸镁0.4g，蒸馏水余量；pH7.0。具体的，是将NAP加入改良BSM基础盐液体培养基；将吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液接种于改良BSM基础盐液体培养基，在在150-200rpm、30-35℃的条件下恒温震荡培养。上述方法，优选的，改良BSM基础盐液体培养基中酵母提取物的含量为10g/L。上述方法，优选的，培养条件为转速175rpm，温度30℃；其他条件相同情况下，在此培养条件下菌B1213对NAP的降解率最高。上述方法，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液相对于改良BSM基础盐液体培养基的接种量的变化，对单位时间内的NAP降解率有明显影响；通常情况下，接种量越多，单位时间内降解率越高；但是对最终降解率（发酵液中NAP含量达到稳定时的降解率）没有明显影响。上述方法，所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液是由吡咯伯克霍尔德氏菌B1213培养获得的。在获得吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的条件下，本领域技术人员通过常规操作即可以获得吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液。本专利技术中，对于某个成分的含量的百分比，如果没有特别说明，均指重量百分比（w/w）。本专利技术所用专业术语说明：rpm是转速单位，1rpm是指每分钟旋转一转。有益效果：（1）首次分离培养出能够降解萘的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213；（2）吡咯伯克霍尔德氏菌B1213对萘的降解率高达为96.89%；（3）本专利技术降解萘的方法，与本专利技术之前细菌、真菌降解萘的方法相比，在菌种来源上具有新意，其对萘的降解率较高，降解周期短，操作简单。保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所保藏日期：2016年7月21日保藏编号：CGMCCNo.12806分类命名：吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderiapyrrocinia）。附图说明图1为本专利技术中所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的显微镜下形态特征；图1中，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213为杆状的革兰氏阴性菌，不能形成芽孢；图2为采用紫外分光光光度法获得的吸光值（OD）-萘浓度标准曲线；图3为吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的16SrDNA序列系统发育分析；图4为吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的recA序列系统发育树分析。具体实施方式下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1菌株B1213的鉴定菌株B1213分离自土壤，其形态如图1所示，属于杆状的革兰氏阴性菌，不能形成芽孢。提取其基因组DNA，并利用16srDNA和BCR1引物对于该基因组DNA进行聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,简称NCBI)数据库进行菌株比对。(1)16SrDNA序列分析：16srDNA正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,如SEQIDNO.1所示；16srDNA反向引物1492R：5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，如SEQIDNO.2所示；扩增所得16SrDNA序列如SEQIDNO：3所示，序列全长为1411bp。将该扩增所得16SrDNA序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图3。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出菌株“B1213”与模式菌株BurkholderiastabilisLMG28156、同源性达99.7％。(2)recA基因序列分析BCR1基因正向引物：5'-TgACCgCCgAgAAgAgCAA-3'，如SEQIDNO.4所示；BCR2基因反向引物：5'-CTCTTCTTCgTCCATCgCCTC-3'，如SEQIDNO.5所示；扩增所得recA基因序列如SEQIDNO：6所示，序列全长为974bp。将该扩增所得recA基因序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图4。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出出菌株“B1213”与模式菌株BurkholderiapyrrociniaDSM10685T(CP011503)同源性达97.9％。因此可以判定B1213为一种全新的吡咯本文档来自技高网...

【技术保护点】
吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）B1213的一种用途，用于降解萘；所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12806；保藏时间为2016年7月21日。

【技术特征摘要】
1.吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderiapyrrocinia）B1213的一种用途，用于降解萘；所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12806；保藏时间为2016年7月21日。2.一种采用权利要求1所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213降解萘的方法，其特征在于：在酵母提取物存在的条件下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213与萘接触。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在改良BSM基础盐液体培养基存在的条件下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213与萘接触；所述改良BSM基础盐液体培养基，每1L中含有以下成分：酵母提取物2-10g，硫酸铵...

【专利技术属性】
技术研发人员：郦金龙，李秀婷，滕超，朱运平，申卫家，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：北京;11