本发明专利技术涉及一种来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因及其应用。所述丙烯酰胺水解酶基因采用人工方法合成，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO?1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ?ID?NO?2所示。将该丙烯酰胺水解酶基因采用农杆菌蘸花法转化拟南芥，结果发现该丙烯酰胺水解酶基因成功的使得转基因拟南芥具有了分解丙烯酰胺的功能，这使得其他植物修复丙烯酰胺污染成为了可能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属植物基因工程领域，具体涉及一种来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因及其应用。
技术介绍
丙烯酰胺(CH2 = CH-CONH2, Acrylamide)是一种白色晶体物质，分子量为70. 08， 是1950年以来广泛用于生产化工产品聚丙烯酰胺的前体物质。聚丙烯酰胺主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。由于丙烯酰胺具有潜在的神经毒性、遗传毒性和致癌性，对人类健康产生了极大的威胁。为此，如何降解环境中残留的丙烯酰胺是一个迫切需要解决的问题。植物修复(Phytoremediation)是利用绿色植物来转移、容纳或转化污染物使其对环境无害。植物修复的对象是重金属、有机物或放射性元素污染的土壤及水体。研究表明，通过植物的吸收、挥发、根滤、降解、稳定等作用，可以净化土壤或水体中的污染物，达到净化环境的目的，因而植物修复是一种很有潜力、正在发展的清除环境污染的绿色技术。中国土壤修复专家正在试验砷、铜、锌等重金属污染土壤的植物修复技术，通过在矿区及其周边重金属污染土地种植超富集植物，吸收土壤中对人体有害的重金属物质。目前还未有关于丙烯酰胺植物修复方面的文献报道，因而发掘新型的丙烯酰胺降解方法是必要的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题之一，在于提供一种来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因。本专利技术所要解决的技术问题之二，在于提供该来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因在植物修复中的应用，即将该来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因转入植物体内，并对该转基因植物进行功能验证，以证明它具有降解丙烯酰胺的功能。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案来实现。所述的来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。该丙烯酰胺水解酶基因长l(^6bp， 含10 个碱基，编码的氨基酸342个。所述的来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因，采用人工方法合成。即依照PTDS(PCR-based two-step DNA synthesis，PTDS)方法克隆源自伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺酶基因(ACMD)，进行化学合成，在保持ACMD基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成本专利技术的丙烯酰胺水解酶基因(ACMDI)。通过农杆菌介导将本专利技术的丙烯酰胺水解酶基因ACMDI转入拟南芥，可应用于丙烯酰胺降解。具体包括如下步骤DACMDI农杆菌双元载体的构建ACMDI基因植物双元载体在pcAMBIA-1301载体的基础上构建而成，在 pCAMBIA-1301载体的多克隆位点处插入两端附加了烟草的染色质附着SAR序列的外源基因的表达单元，这有利于转基因的稳定遗传；在外源基因的表达单元内，我们在目的基因的两侧导入了 BamHI和Mcl酶切位点，便于外源基因的插入，外源基因的表达由双CAMV355 启动子+TMV omegaleader sequence ^ffjlJo2)电击法转化农杆菌MicroPulser Electroporation Apparatus Operating Instructions and AppIicationGuide (BIO-RAD公司)制备农杆菌GV3101感受态，并且将构建好的农杆菌双元载体经电击法转入到农杆菌中。3)农杆菌介导转化拟南芥利用蘸花法将构建好的农杆菌转入拟南芥体内。首先将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3 5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22°C培养室，低光强度下生长M小时，即可正常培养。生长约两个月后，收集种子，4°C冰箱贮存待用。4)拟南芥转化植株种子的筛选对上述得到的种子进行筛选，包括GUS组织化学染色分析和转基因阳性植株的 PCR检测得到转入ACMDI基因的拟南芥。5)转基因拟南芥降解丙烯酰胺将得到的转ACMDI基因的拟南芥与野生型拟南芥共同栽培到含有丙烯酰胺的水溶液中，经过一周生长，测定水溶液中丙烯酰胺的含量。HPLC测定表明野生型拟南芥中丙烯酰胺没有减少，而转ACMDI基因的拟南芥水溶液中，丙烯酰胺的检测峰高由1200降低到 700以下。由此说明本专利技术的来源于伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺水解酶基因ACMDI成功的使转基因拟南芥具有了分解丙烯酰胺的功能，这使得其他植物修复丙烯酰胺污染成为了可能。附图说明图1为转ACMDI基因拟南芥的DNA检测电泳图，其中1为marker，2为野生型拟南芥，3-7为转ACMDI基因的拟南芥。图2为获得的转ACMDI基因拟南芥的GUS染色图，其中的4个试管均为染色阳性的转基因拟南芥。图3为转ACMDI基因拟南芥水培在含相同浓度丙烯酰胺溶液5天后HPLC检测结果，其中WT为野生型拟南芥，Tl、T2、T3为转ACMDI基因的拟南芥。具体实施例方式以下结合附图详细描述本专利技术的技术方案。实施例仅用以说明本专利技术的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本专利技术进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本专利技术的权利要求范围中。本专利技术所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本专利技术涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.R.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社。)实施例1丙烯酰胺水解酶基因ACMDI的人工合成依照PTDS(PCR-basedtwo-step DNA synthesis，PTDS)方法克隆源自伯克霍尔德氏菌的丙烯酰胺酶基因(ACMDI)，进行化学合成，在保持ACMDI基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成本专利技术的丙烯酰胺水解酶基因(ACMDI)。设计的引物如下1. Acmdi-I :Tm = 54,60merTCA，GTC，TTC，GTG，CGG，GAT，TCC，TTC，GAT，CGG，ACA，CTC，CGG，CGT，GCC，AGG， GGT, TGG, ACG, CGT2. Acmdi-2 :Tm = 54，60merTGT，GGA，TCC，AGA，CGC，CAC，GCG，TCG，CCG，CGT，CGA，AGC，GCT，CAC，GCG，TCC， AAC, CCC, TGG, CAC3. Acmdi-3 :Tm = 54，60merGCG，TGG，CGT，CTG，GAT，CCA，CAA，TCC，AGT，CGC，GAT，AGA，AGC，CGA，ATG，GAC， AGT，CCG，CGA，CGC4. Acmdi-4 :Tm = 54，60merGGT，TAT，ACC，GGC，ACC，ATT，CAT, TCC，GGC，GAT，GGC，GTG，AAT，GGC，GTC，GCG， GAC, TGT, CCA, TTC5. Acmdi-5 :Tm = 54，60merTGA，ATG，GTG，CCG，GTA，TAA，CCG，CGA，TGC，AGC，AGC，TTG，TAT，AGA，TGG，TTC， TGC，GAC，TGC，ATG 6. AcmdiA-6 :Tm = 54，60merCGG，AGC，TGT，CG本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高建杰，姚泉洪，彭日荷，熊爱生，付晓燕，田永生，赵伟，金晓芬，韩红娟，陈晨，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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