本发明专利技术公开了一种检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸及其制备方法。该检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，包括样品垫１、紧密连接于所述样品垫一端的含有鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体标记胶体金探针的金标垫２、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜（ＮＣ膜）３和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫４；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线５和质控线６，所述检测线为鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体，所述质控线为抗兔抗抗体。本发明专利技术用于临床标本、污染物和环境中鼻疽伯克霍尔德氏菌抗原的检出，也可用于纯培养鼻疽伯克霍尔德氏菌的鉴定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的试纸，特别涉及一种检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，还涉及其制备方法。
技术介绍
鼻疽是由鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallie)引起的一种致死性和传播性均很强的细菌性疾病。鼻疽菌曾命名为鼻疽费氏杆菌(Pfeifferellamallei，1918)、鼻疽恶病杆菌(Malleonydes mallei，1933)、鼻疽放线菌(Adtinoei mallei，1933)、鼻疽吕氏杆菌(Loefferella mallei，1935)、鼻疽不动杆菌(Acinetobacter mallei，1964)和鼻疽假单胞菌(Pseudomonas，mallei1966)，1993年命名为鼻疽伯克霍尔德氏菌。由于鼻疽菌容易获得，致病性强，致死率高，如未及时治疗，病死率高达100％。被公认为经典的生物战剂，已被列入《国际禁止生物武器公约》核查清单。第一次世界大战期间，德国间谍在东部战场蓄意用鼻疽菌感染了大批俄罗斯的马和牛，使战后俄罗斯人鼻疽的发病数增加；第二次世界大战期间，日本人在中国的哈尔滨研究可能使用的生物武器，蓄意将马、平民和战俘感染上鼻疽；二战后美国和前苏联一直将鼻疽菌作为潜在的生物武器研究。“9.11”以后，美国国家反恐预案将鼻疽菌列为可能用于生物恐怖袭击的烈性病原微生物。因此，鼻疽菌的快速检测是反生物恐怖的重要内容(Bossi P，Guihot A，Bricaire F.Emerging or re-emerging infections that can be used for bioterrorismPresse Med.2005 Jan 29；34(2Pt 2)149-155)。鼻疽菌检测的经典方法鼻疽的临床表现复杂易变，不易诊断，必须借助实验室的试验结果做判断，包括细菌学检查和血清学试验。临床采集患者鼻腔分泌物、痰、皮肤溃疡分泌物或脓肿穿刺物，直接涂片镜检，同时接种4％甘油肉汤琼脂，按照分离培养、生化反应、玻片血清凝集和动物感染试验程序检验。鼻疽菌为两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，3～5μm长，0.5～1μm宽，散在分布，无鞭毛，无芽孢，无荚膜。鼻疽菌为需氧菌，在4％甘油琼脂上生长良好。根据生化反应和动力试验可将鼻疽菌与类鼻疽菌和绿脓假单胞菌区别开。聚合酶链反应(PCR)是鼻疽菌快速检测方法中最常用的技术，最初根据鼻疽菌23S rRNA基因设计引物CVMP2315′AAA CCG ACA CAG GTG G 3′；M2325′CAC CGA AAC TAG CA 3′，用于鼻疽菌的鉴定(Adolf Bauernfeind，CarstenRoller Molecular procedure for rapid detection of Burkholderia malleiand Burkholderia pseudomallei.J.Clin.Microbiol，1998，362737-2741)；应用鼻疽菌23S rRNA基因设计引物，也可获得明确的鼻疽菌鉴定结果(Gee JE，Sacchi CT，Glass MB，De BK.Use of 16S rRNA gene sequencing for rapididentification and differentiation of Burkholderia pseudomallei and B.mallei.J Clin Microbiol.2003，41(10)4647-4654)；近年来将实时定量PCR(real-time PCR)技术用于临床标本中鼻疽菌的检测，可检出1～10cfu/ml鼻疽菌(Tomaso H，Scholz HC，Al Dahouk S，Eickhoff M Development of a5’-nuclease real-time PCR assay targeting fliP for the rapididentification of Burkholderia mallei in clinical samples.Clin Chem.2006，52(2)307-310；Novak RT，Glass MB，Gee JE，Gal D，Mayo MJ.Developmentand evaluation of a real-time PCR assay targeting the type III secretionsystem of Burkholderia pseudomallei J Clin Microbiol.200644(1)85-90)。免疫胶体金技术是近年来迅速发展的快速检测技术，该技术与其它方法比较，优势在于检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。目前尚无见到免疫层析试纸检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸(Immuno-Chromatographic Assay，ICA)。本专利技术所提供的检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有鼻疽伯克霍尔德氏菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的硝酸纤维膜(NC膜)和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的一条检测线和一条质控线，所述检测线为鼻疽伯克霍尔德氏菌特异性抗体，所述质控线为能与所述鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体特异结合的抗抗体。所述鼻疽伯克霍尔德氏菌特异性抗体优选为兔抗体，所述质控线优选为抗兔抗抗体。检测样品时可将检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的样品垫直接浸于样品中；为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还紧密连接有背板，背板的材料可以是多种多样的，如塑料、聚氯乙烯板(PVC板)等。再将该带有背板的试纸装入试剂盒中，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。本专利技术的第二个目的是提供一种制备上述检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的方法。本专利技术所提供的制备上述检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤1)制备鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体，将鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的一个区域，得到检测线；将抗兔IgG的抗抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的另一区域，得到质控线；37℃干燥2.5-5.5小时，然后将其粘贴在吸水纸垫上。2)制备含有鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体标记免疫胶体金探针溶液；取5ml，加入0.5-0.65g蔗糖充分溶解，将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，-20℃～-50℃放置10-11小时后，冻干机抽干，将其粘贴在步骤1)得到的纤维膜的靠近所述检测线的一端。3)将在步骤2)中得到的金标垫上面再粘贴样品垫，得到检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸。为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还粘贴背板。本专利技术所述鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体标记胶体金探针可由下述方法制备1)将HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸，搅动下准确加入1.6ml的1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，包括样品垫（１）、紧密连接于所述样品垫一端的含有鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体标记胶体金探针的金标垫（２）、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜（３）和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫（４）；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线（５）和质控线（６），所述检测线为鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体，所述质控线为能与所述鼻疽伯克霍尔德氏菌抗体特异结合的抗抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：端青，朱虹，何君，檀华，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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