本发明专利技术公开了一种检测类鼻疽菌抗原的免疫层析试纸及其制备方法。该免疫层析试纸，包括样品垫１、紧密连接于所述样品垫一端的含有类鼻疽菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫２、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜（ＮＣ膜）３和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫４；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线５和质控线６，所述检测线为类鼻疽菌特异性抗体，所述质控线为羊抗兔ＩｇＧ。本发明专利技术用于临床标本、污染物和环境中类鼻疽菌抗原的检出，也可用于纯培养类鼻疽菌的鉴定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种免疫层析试纸，特别涉及一种检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，还涉及其制备方法。
技术介绍
类鼻疽是由类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallie)引起的一种致死性和传播性均很强的细菌性疾病。最初由Whitmore分离自缅甸仰光，命名为惠特姆尔杆菌(Bacillus whitmore，1921)，后又多次易名，如类鼻疽恶病杆菌(Malleonydes pseudo mallei，1939)、类鼻疽吕氏杆菌(Loefferella pseudomallei，1951)和类鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mallei，1957)，1993年命名为类鼻疽伯克霍尔德氏菌。类鼻疽菌是经典的生物战剂，被列入《国际禁止生物武器公约》核查清单。类鼻疽菌容易获得，致病性强，感染后如不及时治疗，可在3～4天内死亡，对外界环境的抵抗力强，在粪便中可存活27天，尿液中存活17天，腐败尸体中存活8天。感染途径可以通过呼吸道、消化道和皮肤粘膜侵入，容易被用来进行生物恐怖袭击。“9.11”以后，美国国家反恐预案将类鼻疽菌列为可能用于生物恐怖袭击的烈性病原微生物。因此，类鼻疽菌的快速检测是反生物恐怖的重要内容(Bossi P，Guihot A，Bricaire F.Emerging or re-emerging infectionsthat can be used for bioterrorism Presse Med.2005 Jan 29；34(2 Pt2)149-155；Christensen JJ，Andresen K，Kemp M.New diagnost ic methodsfor bacterial infections after the introduction of increased bioterrorismpreparedness 2005，5167(36)3416-3417)。类鼻疽的临床类型有3种急性暴发型、亚急性型和慢性型，临床表现复杂易变，不易诊断，必须借助实验室的试验结果做判断，包括细菌学检查和血清学试验(White NJ.Melioidosis.Lancet.2003，17361(9370)1715-1722)。临床采集鼻腔分泌物、痰、皮肤溃疡分泌物或脓肿穿刺物，直接涂片镜检，同时接种4％甘油肉汤琼脂，按照分离培养、生化反应、玻片血清凝集和动物感染试验程序检验。类鼻疽菌为两端钝圆、两极浓染的革兰氏阴性杆菌，散在分布，有鞭毛因而有动力，在组织中可形成所谓的假荚膜。类鼻疽菌为需氧菌，在4％甘油琼脂上生长良好。根据生化反应和动力试验可将类鼻疽菌与鼻疽菌和绿脓假单胞菌区别开，这是类鼻疽菌检测的经典方法。聚合酶链反应(PCR)扩增鼻技术是类疽菌快速检测方法中最常用的技术，最初根据类鼻疽菌23S rRNA基因设计引物CVMP2315′AAA CCG ACA CAG GTG G3′；M2325′CAC CGA AAC TAG CA 3′，用于类鼻疽菌的鉴定(Adolf Bauernfeind，Carsten Roller Molecular procedure for rapid detection of Burkholderiamallei and Burkholderia pseudomallei.J.Clin.Microbiol，1998，362737-2741)；应用类鼻疽菌23S rRNA基因设计引物，也可获得明确的类鼻疽菌鉴定结果(Gee JE，Sacchi CT，Glass MB，De BK.Mse of 16S rRNA genesequencing for rapid identification and differentiation of Burkholderiapseudomallei and B.mallei.J Clin Microbiol.2003，41(10)4647-4654)。近年来将实时定量PCR(real-time PCR)技术用于临床标本中类鼻疽菌的检测，可检出1～10cfu/ml类鼻疽菌(Novak RT，Glass MB，Gee JE，Gal D，Mayo MJ.Development and evaluation of a real-time PCR assay targeting the typeIII secretion system of Burkholderia pseudomallei J Clin Microbiol.2006，44(1)85-90)。免疫胶体金技术是近年来迅速发展的快速检测技术，该技术与其它方法比较，优势在于检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。目前尚无见到免疫层析试纸检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸(Immμno-Chromatographic Assay，ICA)。本专利技术所提供的检测类鼻疽菌的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫一端的含有类鼻疽菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(Nc膜)和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为类鼻疽菌特异性抗体，优选为兔抗体，所述质控线为羊抗兔IgG。为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还紧密连接有背板。背板的材料可以是多种多样的，如塑料、树脂等。本专利技术的第二个目的是提供一种制备上述检测类鼻疽菌的免疫层析试纸的方法。本专利技术所提供的制备上述检测类鼻疽菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤1)制备类鼻疽菌特异性抗体，将类鼻疽菌特异性抗体喷到纤维膜上，包被NC膜的一个区域，得到检测线；将抗兔IgG的抗抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的另一区域，得到质控线；37℃干燥2.5-4.5小时，然后将其一端粘贴在吸水纸垫上；2)制备含有类鼻疽菌特异性抗体标记免疫胶体金探针溶液，取5-6ml，加入0.5-0.6g蔗糖充分溶解，将玻璃纤维或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，-20℃～-50℃放置8-12小时，冻干机抽干即得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维膜的靠近所述检测线的一端；3)在步骤2)中的金标垫上面再贴样品垫，得到检测类鼻疽菌的免疫层析试纸。为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还粘贴背板。本专利技术所提供的检测类鼻疽菌的免疫层析试纸及其制备方法中，所述类鼻疽菌特异性抗体标记胶体金探针可由下述方法制备1)将HAμCl4配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸，搅动下准确加入1.6ml的1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，继续加热煮沸10-15分钟，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液，冷却后用水恢复至原体积；2)用K2CO3或HCl调pH值为8.2-9.5，按30μg/ml加入类鼻疽菌特异性抗体，搅拌20-30分钟，配制类鼻疽菌抗体的免疫胶体金探针溶液。然后加入10％BSA 5ml，搅拌20-25分钟，加1ml 10％PEG20000，搅拌20-25分钟，2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测类鼻疽菌的免疫层析试纸，包括样品垫（１）、紧密连接于所述样品垫一端的含有类鼻疽菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫（２）、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜（３）和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫（４）；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线（５）和质控线（６），所述检测线为类鼻疽菌特异性抗体，所述质控线为抗兔抗抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：端青，檀华，何君，朱虹，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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