本发明专利技术涉及脂肪酶基因突变库高通量筛选方法和采用该方法筛选得到的脂肪酶突变基因及其编码脂肪酶。采用本发明专利技术的方法与现有的方法相比，灵敏度更高。本发明专利技术的突变脂肪酶相比野生型具有更高的比活力。本发明专利技术还涉及一种用于筛选脂肪酶的反应体系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域。具体而言，本专利技术涉及ー种脂肪酶基因突变库高通量筛选方法及由此筛选得到的新的脂肪酶突变基因。
技术介绍
脂肪酶(E. C. 3. I. I. 3)亦称酰基甘油水解酶，是ー类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其它ー些水不溶性酯类的水解、还可以用于催化酯交换反应、醇解反应、转酯化及酯类的逆向合成反应，以及生物表面活性剂的合成、催化旋光异构体的拆分和手性药物的合成等。脂肪酶在粮油生产、食品エ业、日用化学エ业、油脂化学エ业、农业化学エ业、造纸エ业、洗涤剂エ业、以及药物合成等许多领域得到广泛应用。在油脂生产和油脂化工方面，脂肪酶具有巨大应用潜力。利用其专ー性催化性能，改变脂肪酸链在甘油酯中的位置或替换上I个或多个新的脂肪酸来修饰酷，将廉价的油脂原料加工成昂贵的结构脂，如可可脂、0P0,单苷脂和苷ニ脂等。提高脂肪酶的催化比活力，是降低脂肪酶生产成本的有效的途径之一。本专利技术以具有I，3专ー性的米黑根毛霉脂肪酶为研究对象，首先采用易错PCR方法(ep-PCR)，在大肠杆菌中建立脂肪酶突变库，通过新的高通量筛选方法，对突变库进行筛选，获得了比活力提高的RML突变脂肪酶和相应的突变基因。
技术实现思路
本专利技术提供一种分离的多肽，所述多肽选自(I)SEQ ID NO :4、6、8、10 或 12 所示氨基酸序列；和(2)在(I)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以SEQ ID NO :2的氨基酸序列编号计第57位氨基酸残基为Val，且具有脂肪酶活性的由(I)衍生的多肽。在一具体实施例中，以SEQ ID NO 2的氨基酸序列编号计，上述⑵所述的多肽至少还保留ー个或多个以下位置上的残基第67位的Ala、第111位的Thr、第168位的Pro和第65位的Ala。本专利技术提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸选自(I)编码本专利技术所述多肽的多核苷酸；和(2)与(I)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在一具体实施例中，该多核苷酸编码如SEQ ID N0:4、6、8、10或12所示的多肽。在一具体实施例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :3、5、7、9或11所示。本专利技术提供ー种载体，它含有本专利技术所述的多核苷酸。本专利技术提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本专利技术所述的载体或多核苷酸。本专利技术提供一种筛选脂肪酶的方法，所述方法包括以甘油三酯作为待筛选脂肪酶的底物进行酶解并根据PH指示剂产生的颜色变化筛选出比活力提高的脂肪酶的步骤。在一具体实施例中，所述方法包括以下步骤(I)提供待筛选的脂肪酶；(2)提供含有pH指示剂和低级烷基羧酸盐的溶液；(3)将甘油三酯加到步骤⑵的溶液中，得到混合液；(4)将脂肪酶加到步骤(3)所得的混合液中；和(5)观察混合液顔色的变化，根据pH指示剂所产生的颜色变化筛选出比活力提高的脂肪酶。在一具体实施例中，所述甘油三酯为脂肪酸碳链长度为12-22的甘油三酷。在一具体实施例中，所述低级烷基羧酸盐为长2-6个碳原子烷基羧酸的IIA族金·属盐。在一具体实施例中，所述pH指示剂选自溴百里酚蓝、苯酚红、亚甲蓝、中性红、甲基红、溴甲酚绿、甲基橙、溴酚蓝、刚果红或其组合。在一具体实施例中，所述方法还包括使用野生型脂肪酶作为对照，通过对比待筛选脂肪酶产生的顔色与对照产生的顔色筛选出比活力提高的脂肪酶。在一具体实施例中，所述方法是使用多孔板进行筛选。在一具体实施例中，所述方法还包括建立脂肪酶突变文库；表达突变脂肪酶。在一具体实施例中，所述方法还包括采用碱滴定法对所筛选得到的脂肪酶进行复筛，筛选出比活力提高的脂肪酶。本专利技术提供ー种用于筛选脂肪酶的反应体系，所述反应体系含有(I)甘油三酯；和(2) pH 指示剂。在一具体实施例中，所述反应体系还含有低级烷基羧酸盐。在一具体实施例中，姆200 ii I所述反应体系计,所述反应体系含有15 25 ill的PH指示剂溶液、50 70 ill的0. I 0. 3M低级烷基羧酸盐的Tris缓冲溶液、和80 120 u I甘油三酯溶液，其中，所述pH指示剂溶液为pH指示剂以0. 3 I. 5mg/L的浓度溶解于Tris缓冲液，所述甘油三酯溶液为甘油三酯以I :4 6的体积比溶于有机溶剂而获得的溶液。在一具体实施例中，所述反应体系的pH在4. 0 9. 0的范围内。在一具体实施例中，所述反应体系的pH在5. 0 9. 0的范围内。在其它具体实施例中,所述反应体系的pH在4. 0 7. 0的范围内。在其它具体实施例中，所述反应体系的pH在7. 0 9. 0的范围内。在一具体实施例中，所述甘油三酯为脂肪酸碳链长度为12-22的甘油三酷。在一具体实施例中，所述低级烷基羧酸盐为长2-6个碳原子烷基羧酸的IIA族金属盐。在一具体实施例中，所述pH指示剂选自溴百里酚蓝、苯酚红、亚甲蓝、中性红、甲基红、溴甲酚绿、甲基橙、溴酚蓝、刚果红或其组合。附图说明图I显示筛选方法灵敏性验证结果。图2显示采用本专利技术方法和已知方法对脂肪酶催化活性进行筛选的結果。图3显示脂肪酶基因的PCR結果。I号泳道为用于克隆至pET30a载体的PCR片段，2号泳道为用于克隆至pET32a载体的PCR片段，3号泳道为用于克隆至pET22b载体的PCR片段。图4显示阳性克隆鉴定。其中，A图显示pET30a_脂肪酶的阳性克隆鉴定，B图显示pET32a-脂肪酶的阳性克隆鉴定，C图显示pET 22b-脂肪酶的阳性克隆鉴定，箭头所指为脂肪酶基因的条带，出现箭头所示的目标条带的克隆即为阳性克隆。图5显示重组子进行诱导表达后进行的SDS-PAGE电泳結果。M:蛋白质电泳Marker ；C :未诱导的菌体超声破碎后作对照；1 :以pET32a为载体，表达的蛋白大小大约为50kD ；2 :以pET30a为载体，表达的蛋白大小约为38kD ；3 :以pET22b为载体，表达的蛋白大小约为38kD。箭头所指为重组脂肪酶蛋白条带。图6显示易错PCR結果。图7显示脂肪酶经过定向进化和定点改造后比活力的变化趋势。图8显示考马斯亮蓝测蛋白质浓度的标准曲线。图9显示本专利技术采用的酸碱滴定法的具体流程。具体实施例方式如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的多肽”或“分离的脂肪酶”是指脂肪酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化脂肪酶。本专利技术的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本专利技术的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、丝状真菌、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本专利技术的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。在本专利技术中，术语“脂肪酶”包括具有脂肪酶活性的SEQ ID NO :4、6、8、10或12所示的多肽。该术语还包括具有脂肪酶功能的、SEQ ID NO :4、6、8、10或12的变异形式。这些变异形式包括(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽选自：(1)SEQ？ID？NO：4、6、8、10或12所示氨基酸序列；和(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以SEQ？ID？NO：2的氨基酸序列编号计第57位氨基酸残基为Val，且具有脂肪酶活性的由(1)衍生的多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于洪巍，毛爱军，王珏，王丹，宣姚吉，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
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