本发明专利技术公开了GDSL蛋白在制备脂肪酶中的新用途。本发明专利技术提供了GDSL蛋白的应用，为如下（1）或（2）：（1）制备脂肪酶；（2）降解脂肪酶的底物；所述GDSL蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白质。本发明专利技术发现GDSL蛋白具有脂肪酶活性，将GDSL蛋白用作脂肪酶具有如下优点：可以采用较高的反应温度；具有良好的热稳定性；可以在碱性条件下作用；具有良好的pH稳定性；对C2-C12的底物均可发挥作用；酶活力较高。本发明专利技术为涉及脂肪酶的工艺流程开辟了一条新途径，具有重大的经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及⑶SL蛋白在制备脂肪酶中的新用途。
技术介绍
脂肪酶(lipase,triacylglycerolacylhydrolases,EC3. I. I. 3)即三酸基甘油酰基水解酶，是工业酶制剂中最重要的酶类之一，能够在油水界面催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，同时还能催化酯交换、转酯、酯合成、醇解、酸解、氨解等多种化学反应，通常具有催化效率高、催化条件简单的优点。目前工业上应用的脂肪酶大多为微生物产生的胞外酶，从反应温度来说多为中温酶(最适反应温度37-40°C )，在高温下反应受到限制。嗜热酶是指最佳催化温度60-85°C的酶，具有化学催化剂无法比拟的优点，如催化效率高、作用温度广泛(在高温下的稳定性也 较好)、作用PH广泛等，因而能克服中温酶(20-55°C )及低温酶(2-20°C )在应用过程中出现的生物学性质不稳定的现象，可以取代传统的中温酶催化及化学催化，为优化工艺流程开辟了一条新途径。利用热稳定性好的脂肪酶作为生物催化剂具有如下优点⑴由于该脂肪酶的稳定性高，可在室温下分离提纯和包装运输、并能长久保持活性，从而制备脂肪酶的成本降低；(2)对反应器冷却系统的要求标准低，从而减少了能量消耗，且由于其耐高温特性，在生产中不需要复杂的冷却装置，既节省了开支又降低了冷却过程对环境造成的污染；(3)随反应温度的提高，酶分子运动速度加快，催化能力加强，加快了动力学反应，从而使用效率得到了提高；(4)由于采用高温反应条件，降低了中温微生物污染反应体系的危险，从而提高了产物纯度，同时高温反应条件还提高了有机化合物的生物可利用性和可溶性，从而实现了有效的生物修复。脂肪酶的热稳定性问题一直是脂肪酶研究及生产和应用的瓶颈问题，就目前脂肪酶的研究现状来看，仅通过蛋白质工程来改善脂肪酶特性，远不能解决各个领域对脂肪酶的要求。因此，寻找发现具有新特性、耐热、高活力、符合现代生物工程要求的脂肪酶是一项非常有意义的工作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供GDSL蛋白在制备脂肪酶中的新用途。本专利技术提供了⑶SL蛋白的应用，为如下(I)或(2)(I)制备脂肪酶；(2)降解脂肪酶的底物；所述⑶SL蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表的序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白质。应用所述GDSL蛋白降解脂肪酶的底物时，所述降解的反应条件为30-80 V、pH6. 5-8. O，所述降解的反应条件优选为65°C、pH7. 5。所述脂肪酶的底物为对硝基苯基乙酸酯、丁酸对硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕榈酸酯中的至少一种。本专利技术还保护将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将所述⑶SL蛋白的编码基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点得到的重组质粒。所述⑶SL蛋白的编码基因具体可为如下I)至4)中任一所述的DNA分子I)序列表的序列3自5’末端第I至792位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白的 DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子。所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21 (DE3)。本专利技术还保护一种制备⑶SL蛋白的方法，是培养以上所述的重组菌，得到所述⑶SL蛋白。所述方法中，所述培养的具体步骤为将重组菌接种至LB液体培养基(含100 μ g/mL卡那霉素)，振荡培养至0D_达到O. 8，然后加入IPTG (诱导剂)至浓度为Immo/L，20°C、200rpm振荡培养12小时。所述方法中，在培养重组菌后还包括超声破碎和将超声破碎的上清进行亲和层析的步骤。所述超声破碎的具体参数为功率300W、总工作时间90min,每工作5s间歇8s), 12000rpm离心IOmin,收集上清液。所述亲和层析具体可为镍柱亲和层析。本专利技术还保护一种降解脂肪酶的底物的方法，是采用所述GDSL蛋白降解脂肪酶的底物。所述降解的反应条件为30-80°C、pH6. 5-8. O。所述降解的反应条件优选为65°C、pH7. 5。所述脂肪酶的底物具体可为对硝基苯基乙酸酯、丁酸对硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕榈酸酯中的至少一种。本专利技术发现所述GDSL蛋白具有脂肪酶活性，将所述GDSL蛋白用作脂肪酶，具有如下优点可以采用较高的反应温度；具有良好的热稳定性；可以在碱性条件下作用；具有良好的PH稳定性；对02-(12的底物均可发挥作用；酶活力较高。本专利技术为涉及脂肪酶的工艺流程开辟了一条新途径，具有重大的经济价值。附图说明图I为实施例I中60°C培养条件下复筛获得脂肪酶菌株。图2为实施例I中各个菌株的酶活初测结果。图3为⑶SL蛋白的三维结构预测图。图4为重组质粒pET_28a - B2的结构示意图。图5为在大肠杆菌中诱导表达⑶SL蛋白的SDS-PAGE ;1、分子量标记，2、对照菌得到的上清液、3、重组菌得到的上清液。图6为对硝基苯酚一吸光度标准曲线。图7为纯化后蛋白的电泳图。图8为目的蛋白的质谱鉴定结果。图9为实施例3中的最适pH及pH稳定性测定结果。图10为实施例3中的最适温度及热稳定性测定结果。图11为实施例3中各个试剂对酶活的影响。图12为实施例3中各个有机溶剂对酶活的影响。图13为实施例3中去污剂对酶活的影响。图14为实施例3中蛋白酶对酶活的影响。 图15为实施例4中对不同碳链长度底物特异性。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。载体pET-28a(+) :Novagen，GR201023。大肠杆菌BL21 (DE3):北京全式金生物技术有限公司，CD601-01。对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP) :Sigma，1492-30-4。对硝基苯酚(PNP)Sigma,4043-96-3。CHAPS 的英文全称为 3-propanesulfonate )。实施例I、野生菌的获得以及脂肪酶的发现一、产脂肪酶菌株筛选初筛培养基(g/L)=(NH4)2SO4 lg、NH4N03 lg、NaCl lg、MgS04 ·7Η20 0. lg、K2HP03lg、FeSO4 · 7Η20 O. Olg、Na2CO3 调 PH 至 8. O,再加 I. 0% 橄榄油，灭菌。液体发酵培养基(g/L):可溶性淀粉10g、(NH4)2SO4 5g、K2HPO3 lg、玉米浆粉20g、黄豆饼粉20g、三油精10g，pH8. O。初筛池塘底泥样品取自浙江嘉兴欣欣饲料有限公司的混养鱼池塘，取样时间为2009年7月，4°C条件保存样品。将池塘底泥样用无菌PBS缓冲液进行十倍梯度稀释，取100微升涂布于初筛培养基，放于60°C温度下进行培养，产脂肪酶菌株能够降本文档来自技高网...
【技术保护点】
GDSL蛋白的应用，为如下（1）或（2）：（1）制备脂肪酶；（2）降解脂肪酶的底物；所述GDSL蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表的序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周志刚，何夙旭，徐俐，杨雅麟，张美超，李青，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：
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