本发明专利技术公开了一种patatin-like磷脂酶及其编码基因与用途；本发明专利技术所述的来源于深海宏基因组的patatin-like磷脂酶基因，该基因大小为912bp，序列如SEQ?ID?NO.1所示，编码303个氨基酸，序列如SEQ?ID?NO.2所示，蛋白分子量为33kDa，等电点为6.21。本发明专利技术克隆得到了深海plp基因，并首次分析了其产物及摸索出通过基因工程大量制备该酶蛋白的方法。所述PLP蛋白可水解对硝基苯酚乙酸酯pNPA、对硝基苯酚丁酸酯pNPB、对硝基苯酚辛酸酯pNPO、对硝基苯酚癸酸酯pNPDE、对硝基苯酚月桂酸酯pNPDO。本发明专利技术提供的PLP可水解脂类物质，具有工业化生产潜力和经济价值。
Patatin-like phospholipase and its coding gene and use
The invention discloses a phospholipase patatin-like and its encoding gene and use; source of the deep-sea metagenomic patatin-like phospholipase gene, the gene sequence of size 912bp, such as SEQ? ID? NO.1, encoding 303 amino acid sequences such as SEQ? ID? NO.2, the molecular weight of the protein was 33kDa, isoelectric point was 6.21. The invention has obtained the deep-sea PLP gene, and analyzed the product for the first time and explored a method for preparing the enzyme protein by gene engineering. The PLP protein can hydrolyze p-nitrophenol acetate, pNPA, p-nitrophenol butyric ester pNPB, p-nitrophenol octanoic acid pNPO, p-nitrophenol, decyl ester pNPDE and p-nitrophenol laurate pNPDO. The PLP provided by the invention can hydrolyze lipid substances, and has the potential of industrial production and economic value.
【技术实现步骤摘要】
patat in-1 i ke磷脂酶及其编码基因与用途
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种。
技术介绍
酶是一种生物催化剂，周围环境(温度、pH、有机试剂等)对它的活性影响很大，很多酶在一些比较苛刻的反映条件下(高温、低温或者强酸碱环境)均会失去活性，这就限制了其应用范围。极端微生物产生的极端酶一直以来都是研究的热点。极端微生物酶的发现，正好弥补了这一不足。其中来源于嗜热微生物的嗜热酶具有独特的生物稳定性和催化活性。利用嗜热酶作为生物催化剂的优点为:(I)酶制剂的制备成本低。(2)对反应器冷却系统的要求标准低，从而减少了能量的消耗。(3)高温反应条件降低了中温微生物污染反应体系的危险，从而提高了产物纯度。(4)高温反映条件提高了反应速率和产率。由于嗜热酶具有催化效率高和底物专一性强，且酶稳定性极好等特性，因而能够在苛刻的工业生产过程中发挥重要的作用。酯类降解酶是所有能够催化酯类化合物水解的酶类的总称。根据作用底物脂肪酸侧链的不同，该类酶可分为3大类，即脂肪酶、酯酶及磷脂酶。脂肪酶水解脂肪酸侧链长度大于10个碳的甘油三酯；酯酶水解脂肪酸侧链小于10个碳的甘油三酯；而磷脂酶的水解底物为不同类型的磷脂。酯 类降解酶可以催化不同酯类的水解合成反应，在生物体内具有重要的生理功能，而且还具有较高的应用价值。酯类降解酶在食品、医药卫生、化学化工、环境保护及能源开发等许多工业领域均具有广泛的应用。比如，脂肪酶可用于作家庭或工业用清洁剂的添加剂；酯酶可应用于奶制品的增香、无脂肪肉的生产、清除有机磷杀虫剂的污染等；磷脂酶可用于抗炎药物、抗肿瘤药物的研制和生产，还可用于油脂脱胶。酯降解酶来源丰富，由于微生物来源酯降解酶具有种类繁多、容易大量快速制备和成本低等特点，已经成为当前业应用的最重要途径。但是大部分野生菌株的酯降解酶生产能力往往很有限，无法满足工业生产的要求此外，为了适应工业生产过程中苛刻的反映条件(高温、高压、高酸、高离子浓度以及重金属离子超标的极端环境)。比如在油脂工业，在进行高品质油脂生产过程中，需要对油脂进行脱胶处理以除去磷脂，进而提高油脂的纯度和质量。而高品质油脂生产通常采用物理和化学方法以及酶法进行脱胶。其中酶法脱胶由于工艺相对简单、效率高、环境污染小等优点而受到广泛的青睐。此外，在乳制品加工行业，酯类降解酶的水解催化作用能够在不改变原有奶酪质量的同时提高产量。在烘焙工业中，该类酶可以替代或者增强传统的乳化剂，通过对面粉的极性脂类物质的酶解作用提高产品的乳化质量。油脂脱胶化过程需要较高的温度(70-80°C)，常规酶(猪胰磷脂酶在60°C以内表现最佳活力)，由于反应温度的限制，使脱胶过程的效率和成本都不能达到最佳程度。因此需要我们一方面对现有的酯降解酶进行改造，以适应生产的需要，另一方面需要我们继续从环境中寻找特殊的、新的酶源。在人类极少涉足的深海环境中蕴藏有丰富的生物基因资源。随着我国深海探测技术进步和深海微生物研究的深入，各种深海极端酶已成为获取新型生物催化剂的重要来源。特别的，深海热液区域环境条件特殊，存在极高的海水压力(可达300atm)，喷口处更有高达400°C的海水温度并存在急剧的温度变化(4-4000C ) 0瓜伊马斯海盆是加利福尼亚湾众多半封闭海盆中的一个，它大致在最近350万年内由海底扩张形成。两个断陷位于比较平的盆地底内，由一转换断层水平错开约20公里。富饶的表层水和来自下加利福尼亚及墨西哥大陆的内陆性输入导致海底沉淀物深达400多米。相比于其他已知的深海热泉，瓜伊马斯海盆的独特性在于其不断积聚的沉积物中有机物质在高温条件下被热解成类石油产物如汽油酯、芳香烃以及浙青物质，因此在这个环境中存在着大量的生物。特别的，近年来微生物环境基因组学技术体系的建立使从不可培养微生物样品中直接获得酶资源成为可能。前期我们已构建瓜伊马斯深海宏基因组文库，进一步地，通过构建亚克隆文库，筛选得到一个大小为3.3kb的亚克隆子。测序分析表明，该DNA片段包含4个开放阅读框，通过同源序列比对，确定其中一个阅读框为patatin-like磷脂酶(命名为:PLP)。PLP在序列上与目前已报道的酶同源性较低，最高不到45 其中与Caldithrix abyssi中的patatin、Brevibacillus Iaterosporus中的酯酶具同源性最高,而这些酶的特征目前还未被详细报道。此外，根据目前已报道的文献和已构建的进化树分析，该酶为一个新酶。PLP与目前已报道的Mahella australiensis DSM15567 (No:F4A375)具有较近的亲缘关系，而后者属于Thermoanaerobacterales,且PLP来源于瓜伊马斯热液口样品，因此推测PLP具有较好的热稳定性。对于从深海宏基因组来源分离得到的patatin-like磷脂酶，目前报道较少。Pacawadee等于2008年通过构建泰国温泉样品宏基因组文库，筛选得到具有脂肪降解活性的patatin-like磷脂酶。该酶对p-nitrophenyl butyrate具有较高的特异性,最适温度为70°C，经70°C处理2h还具有较高的热稳定性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来源于深海瓜伊马斯海盆宏基因组文库的；该酶能有效的水解对硝基苯酚乙酸酯pNPA、对硝基苯酚丁酸酯PNPB、对硝基苯酚辛酸酯pNPO、对硝基苯酚癸酸酯pNPDE、对硝基苯酚月桂酸酯pNPDO，尤其对对硝基苯酚丁酸酯pNPB和对硝基苯酚癸酸酯pNPDE催化效率最高，而且该patatin-like磷脂酶为嗜热酶，适合用于需要较高反应温度的工业生产中。宏基因组文库的构建方法为现有技术。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的:第一方面，本专利技术涉及一种如下(a)或(b)的蛋白质:(a)由如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有patatin-like磷脂酶活性的由(a)衍生的蛋白质。优选的,所述蛋白质为重组patatin-like磷脂酶,所述重组patatin-like磷脂酶能够水解对硝基苯酚乙酸酯pNPA、对硝基苯酚丁酸酯pNPB、对硝基苯酚辛酸酯pNPO、对硝基苯酚癸酸酯pNPDE、对硝基苯酚月桂酸酯pNPDO中的一种或几种。更优选用于水解对硝基苯酹丁酸酯pNPB和对硝基苯酹癸酸酯pNPDE ;本专利技术的patatin-like磷脂酶对对硝基苯酚丁酸酯PNPB和对硝基苯酚癸酸酯pNPDE水解的催化效率最高。第二方面，本专利技术涉及一种编码上述蛋白质的核酸序列。优选的，所述核酸序列具体为:核酸序列如SEQ ID N0.1所示；或能与SEQ ID N0.1所示的核酸进行杂交的序列。优选的，所述核酸序列来源深海瓜伊马斯海盆宏基因组文库。第三方面，本专利技术还涉及一种含有上述核酸序列的重组载体。第四方面，本专利技术还涉及一种上述重组载体转化得到的重组基因工程菌。 第五方面，本专利技术还涉及一种上述的核酸序列在制备重组patatin-like磷脂酶中的用途。优选的，所述制备包括如下步骤:构建含所述核酸序列的重组载体，将所述的重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有patatin?like磷脂酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种如下(a)或(b)的蛋白质: (a)由如SEQID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)SEQID N0.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有patatin-like磷脂酶活性的由(a)衍生的蛋白质。2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为重组patatin-like磷脂酶，所述重组patatin-like磷脂酶能够水解对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚辛酸酯、对硝基苯酚癸酸酯、对硝基苯酚月桂酸酯中的一种或几种。3.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。4.如权利要求3所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为:核酸序列如SEQIDN0.1所示；或能与SEQ ID N0.1所示的核酸进行杂交的序列。5.如权利要求3所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列来源于深海热液口瓜伊马斯海盆宏基因 组文库。6.一种含有权利要求3...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐俊，付玲，肖湘，王风平，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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