逆向β氧化途径制造技术

本发明专利技术涉及使用已赋予形成逆向β氧化途径的新用途的基因进行工程化以产生各种化学品的重组微生物。一般而言，通过修饰所需许多循环的各种调节点逆向表达和驱动β氧化循环，然后通过终止酶的作用来将CoA硫酯中间体转化成有用产物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及使用已赋予形成逆向β氧化途径的新用途的基因进行工程化以产生各种化学品的重组微生物。一般而言，通过修饰所需许多循环的各种调节点逆向表达和驱动β氧化循环，然后通过终止酶的作用来将CoA硫酯中间体转化成有用产物。【专利说明】逆向β氧化途径在先相关申请本申请要求2011年2月7日提交的61/440，192的优先权，其通过引用方式全部并入本文中。联邦政府赞助研究声明本专利技术是在国家科学基金会(National Science Foundation)授予的CBET-1134541和CBET-1067565的政府赞助下进行。政府对本专利技术具有某些权力。
本专利技术涉及使用已赋予形成逆向β氧化途径的新用途的基因进行工程化以产生醇类、羧酸类、烷烃类或烯烃类的重组微生物。一般而言，逆向驱动所需许多循环的β氧化循环，然后通过不同类型的终止酶的作用能够将CoA硫酯中间体转化成有用产物:i)硫酯酶、或酰基-CoA:乙酰基-CoA转移酶、或磷酸转酰基酶和羧酸酯激酶(其形成羧酸类)或者ii)形成醇的辅酶-A硫酯还原酶(其制备醇类)或者iii)形成醛的CoA硫酯还原酶和醇脱氢酶(其一起形成醇类)或者iv)形成醛的CoA硫酯还原酶和醛脱羰基酶(其一起形成烷烃类或端烯烃类)或者V)形成链烯烃的酶(例如OleA、OleB、OleC、OleD,其一起形成内烯烃类或端烯烃类或三烯类或者烯醇类)。羧酸类包括不同链长的单羧酸类、β -酮酸类、β -羟基酸类和反式- Λ2-脂肪酸。醇类包括不同链长的正醇类、β -酮醇类、1，3- 二醇类和反式-Λ2-醇类。烷烃类包括不同链长的脂肪族烷烃类。脂肪族烯烃类(也称为链烯烃类)包括端链烯烃类、内链烯烃类、三烯类和烯醇类。
技术介绍
近年来，对诸如乙醇的可再 生燃料的生物制备进行了许多尝试。然而，乙醇并不是理想的燃料，有许多问题，例如高吸湿性、高蒸汽压和低能量密度。这些质量问题使得乙醇不能与液体运输燃料的储存、分配和使用中所使用的现有设施相容。较长链(C ^ 4)醇类(例如正丁醇)、脂肪酸甲酯(FAME)和烃类(烷烃类和烯烃类)提供较乙醇多种优势，包括吸湿性降低、挥发性降低和更高的能量密度。这些质量优势使得正丁醇和其它高级醇类与目前储存、分配和使用的基础设施更加相容。上述长链染料和化学品由短链代谢中间体通过需要延长碳链的途径来生成。然而，迄今为止生物上的成就并不令人满意，特别是引入非天然基因来驱动较长链分子的合成。因此，本领域需要更好的制备较长链(C34)燃料(例如醇类、脂肪酸甲酯、FAME和烃类)的生物方法，它比目前可获得的方法更加有效和实惠。理想的方法也可生产能够用作其它工业的原料的化学品，例如羧酸类和醇类。
技术实现思路
我们已经开发出以产生诸如醇类、羧酸类、烷烃类和烯烃类的化学品的工程化微生物的替代途径，其将β -氧化循环的功能性逆转用作合成具有各种链长度和官能度的醇类和羧酸类的代谢平台(图1Α)。该途径使用辅酶-A(CoA)硫酯中间体操作以及直接使用酰基链延长的乙酰基-CoA (而不是首先需要对丙二酰基-CoA进行ATP-依赖性激活)，其特征在于能够在最大碳和能量效率下合成产物。在大肠杆菌中工程化β_氧化循环的逆转以及联合内源性脱氢酶和硫酯酶使用以合成正醇类、脂肪酸和3-羟基-、3-酮基-和反式-Λ 2-羧酸类。通过在比之前所报道的更高效率下产生更长链的直链正醇类(C ^ 4)和细胞外长链脂肪酸(OlO)来证实工程化途径的更优的性质。β-氧化、醛/醇脱氢酶、硫酯酶、脱羧酶的普遍存在的性质具有使这些产物能够在其它工业有机体中有效合成的潜能，例如酿酒酵母、运动发酵单胞菌、枯草杆菌等。尽管本文中我们已经例证正丁醇、4-C3-羟基_、3-酮基-和反式-Λ 2-羧酸类、较长链(CM)正醇类和长链(OlO)脂肪酸，我们也已经证实通过明智使用起始材料和酶，取决于在工程化微生物中表达何种终止酶，我们也能够制备其它羧酸类、醇类、烷烃类和烯烃类。我们已经工程化在大肠杆菌中制备正丁醇的氧化循环的一次逆转，据认为在没有外源性基因下该生物体不能够制备该醇。该途径，本文称为“内源性”或“天然”基因途径，并不是基于来自天然生成正丁醇的生物体的转移途径，而是通过途径操作赋予天然基因和蛋白产生丁醇的新用途。通常，驱动逆转的β_氧化循环的包括以下三步骤:1)在缺乏它的天然诱导底物(即缺乏脂肪酸)和存在非脂肪酸碳源(例如存在葡萄糖)下功能性表达β氧化循环；2)在逆向/生物合成方向(如与它的天然分解`代谢/降解方向相反)中驱动β氧化循环；以及3)表达在β氧化循环中用作合适中间体的终止酶以制备所需产物。更详细而言，重组工程化为:I)在缺乏天然诱导底物(即缺乏脂肪酸)和存在非脂肪酸碳源(例如存在葡萄糖)下表达氧化循环:为了表达氧化循环，首先i)突变fadR和atoC(c)使能够在缺乏脂肪酸下表达编码β氧化酶的基因；ii)arcA敲除(AarcA)使能够在厌氧/微好氧条件下表达编码β氧化循环酶/蛋白的基因(在制备燃料和化学品中使用微好氧/厌氧条件，但导致通过ArcA表达β氧化基因);以及iii)使用cAMP-依赖性突变体(crp*)来替代天然环状AMP受体蛋白(crp)在存在抑制降解产物的碳源，例如葡萄糖下使能够表达编码β氧化循环酶/蛋白的基因(葡萄糖是在发酵过程中最广泛使用的碳源并且抑制β氧化基因)。2)在逆向/生物合成方向(如与它的天然分解代谢/降解方向相反)中驱动β氧化循环。除了功能性表达β_氧化循环之外，我们提议以下改变方式来达到该途径逆向操作:iv)微好氧/厌氧条件的使用通过三羧酸类(TCA)循环抑制/最小化乙酰基-CoA的代谢以及制备在逆向/生物合成方向中驱动β氧化循环可获得的乙酰基-CoA ;v)pta(或ackA或两者)、poxB、adhE、yqhD和eutE敲除阻断/降低乙酸盐(Δ pta或AackA和poxB)和乙醇(Λ adhE、AyqhD和AeutE)由乙酰基-CoA合成，因而制备可用于在逆向/生物合成方向中驱动β氧化循环的乙酰基-CoA ；vi)硫解酶的过表达，在β氧化循环的逆转中第一步使能够引导乙酰基-CoA至该途径内，因此在逆向方向中进行它的操作；vii) IdhA、mgsA和frdA敲除分别阻断/减少乳酸盐(Δ IdhA和AmgsA)和琥拍酸盐(AfrdA)由丙酮酸盐和磷酸烯醇丙酮酸合成，制备用于合成乙酰基-CoA的更多的磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸盐，因而制备可用于在逆向/生物合成方向中驱动β氧化循环的乙酰基-CoA;viii)丙酮酸盐:黄素氧还蛋白氧化还原酶(ydbK)和酰基-CoA脱氢酶(ydiO和ydiQRST)的过表达使能够偶联丙酮酸盐氧化(丙酮酸盐一乙酰基-COA+C02+Fd,ed)和反式-Λ2-烯酰基-CoA还原(反式_Δ2-烯酸基-CoA+FdMd—酸基-CoA),因此在逆向方向中驱动β氧化。3)将CoA硫酯中间体转化成所需终产物。一般而言，存在若干种从逆向氧化循环中分离反应中间体以及生成所需终产物的终止酶(图1Α):i) CoA硫酯水解酶/硫酯酶、或酰基-CoA:乙酰基-Cok转移酶、或磷酸转酰基酶和用于羧酸类的羧酸酯激酶(即短、中和长链单羧酸类、β_酮酸类、β_本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·冈萨雷斯，J·M·克罗姆伯格，C·德勒莫纳科，E·N·米勒，
申请(专利权)人：威廉马什莱斯大学，
类型：
国别省市：