用于动物饲料的耐热植酸酶制造技术

本发明专利技术提供了被优化在植物中表达、编码耐热植酸酶的合成植酸酶多聚核苷酸，及分离的耐热植酸酶。还提供了包括植酸酶的饲料或食品，以及表达耐热植酸酶的转基因植物。进一步提供了制备和使用耐热植酸酶的方法，如在饲料和食品加工过程中使用耐热植酸酶的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般地涉及分子生物学领域，更具体地说涉及制备和使用耐热植酸酶的方法。
技术介绍
植酸酶(肌醇-六磷酸磷酸水解酶(myo-inositol hexakisphosphatephosphohydrolase)EC3.1.3.8)是将植酸盐(phytate)(肌醇六磷酸盐)水解为肌醇和无机磷酸盐的酶。已知该酶是有价值的食品添加剂。在21世纪来临之际，植酸酶作为动物饲料添加剂的年销售额估计为1亿美元，且仍在增长。家禽和猪饲料目前主要以谷类、豆类和油料种子产品为基础。大约有三分之二的磷(P)以植酸盐，即植酸的盐(肌醇六磷酸盐，InsP6)形式存在于这些饲料中(Jongbloed et al.，1993)。在植物体内，肌醇六磷酸盐中的磷在混合形式的肌醇六磷酸钙-镁-钾盐中以螯合物形式存在，其溶解性非常低(Pallauf and Rimbach，1997)。这种形式的磷对于单胃动物如人类、猪和家禽来说很难消化/利用。对于肌醇六磷酸复合物中结合的肌醇六磷酸磷和矿物质以及微量元素的利用来说，需要植酸酶来水解植酸中以酯型结合的磷酸基团(Rimbach et al.，1994)。植酸酶是一类特殊的磷酸酶，它能够将植酸水解成一系列肌醇的低级磷酸酯和磷酸盐。已知存在有两种类型的植酸酶3-植酸酶和6-植酸酶，提示了易受攻击的磷酸盐酯键。虽然单胃动物缺少足够的植酸酶来有效地利用植酸形式的磷酸，许多真菌、细菌和酵母生成可用于添加到动物食物的植酸酶。有足够的资料说明了补充植酸酶对磷可消化性和动物表现的益处(Mroz et al，1994；Kornegay et al.，1996；Rao et al.，1999；Ravindramet al.，1999)。但是，经常仅利用以生产商的销售策略形式提供的和酶相关的肤浅信息，在特定的(ad hoc)基础上进行了大多数研究。酶制剂的效率不但取决于类型、包涵率(inclusion rate)和所具有的活性水平，还取决于酶在通过胃肠道时所经受的不同条件下，以及在用于预处理食物和饲料制剂的条件下保持活性的能力。虽然多种植酸酶可以用作补充剂，许多酶都具有一定的缺点。例如，目前使用的许多植酸酶都在饲料成丸过程中由于热处理而丧失活性。另外，在补充有低水平磷酸钙的饮食中，目前使用的许多植酸酶都是不够的。并且，许多情况下，微生物表达酶的生产成本高。因此，需要特性得到改善的植酸酶来用于动物饲料和食品加工，以及生产该植酸酶的经济方法。生产更经济的植酸酶的一个方法是通过重组DNA技术产生能够表达植酸酶的转基因植物或植物器官，并将植酸酶添加到动物饲料或人饮食中，直接使用。可替换的方案是，提取植酸酶，如果需要的话，根据所需用途加以纯化。专利技术概述相应地，本专利技术提供了制备和使用编码耐热植酸酶的核酸分子(多聚核苷酸)的方法，所述耐热植酸酶在约60℃30分钟后仍保留至少40％活性、且具有高度的比活(specific activity)，即37℃、酸性pH如pH4.5条件下至少约200U/mg的耐热植酸酶。在一个实施方案中，本专利技术提供了制备耐热植酸酶的方法。该方法包括在植物宿主细胞中表达表达盒(expression cassette)的方法，该表达盒包含和编码耐热植酸酶的核酸分子可操纵性相连接的启动子，其中耐热植酸酶约60℃下30分钟后仍保留至少40％活性、且pH4.5、37℃条件下比活超过200U/mg。在一个优选的实施方案中，该方法进一步包括分离耐热植酸酶。植物宿主细胞可以是单子叶植物细胞，如玉米或小麦细胞，或者双子叶植物细胞，如大豆细胞。在一个优选的实施方案中，用来制备重组耐热植酸酶的植物细胞产生糖基化形式的重组耐热植酸酶。本专利技术还提供了编码耐热植酸酶的多聚核苷酸序列，其中多聚核苷酸序列优化在植物细胞也就是玉米细胞中表达。优选的是，编码耐热植酸酶的多聚核苷酸(第一个多聚核苷酸)可操纵性地和至少一个调控序列，如启动子、增强子、内含子、终止序列或其任意组合相连接，或可选择性地和编码信号序列的第二个多聚核苷酸相连接，其中信号序列将第一个多聚核苷酸编码的酶导向特定的细胞部位，如细胞外部位位置。启动子可以是组成型启动子，如泛素启动子，或者诱导性(条件)启动子。启动子可以是组织特异性的。在一个优选的实施方案中，启动子是胚乳特异性启动子，如玉米γ-玉米醇溶蛋白(zein)谷蛋白-2启动子，优选玉米27-KD的γ-玉米醇溶蛋白谷蛋白-2启动子，或玉米ADP-葡萄糖焦磷酸酶启动子。启动子可以是胚芽(embryo)特异性的启动子，如玉米球蛋白1或玉米油质蛋白18KD启动子。示例性的启动子包括但不限于SEQ ID NO8和SEQ ID NO9。优选的是本专利技术的耐热植酸酶约60℃下30分钟仍保留至少40％活性，较优选的是约65℃下30分钟仍保留至少40％活性，更优选的是约70℃下30分钟仍保留至少35％活性；37℃、酸性pH如小于pH5.0，较优选小于pH4.0且大于pH1.5条件下，比活至少约400U/mg，较优选约600U/mg，更优选约800U/mg。SEQ ID NO1中提供了本专利技术的示例性耐热植酸酶。本专利技术还提供了包含本专利技术表达盒或多聚核苷酸的载体，以及包含本专利技术多聚核苷酸、表达盒或载体的植物细胞和转化植物细胞。本专利技术的载体还编码多个多肽，包括多个耐热植酸酶；还编码包含本专利技术耐热植酸酶的融合多肽，植物细胞可以包含一个或多个本专利技术的载体。本专利技术的转化植物细胞可用于制备本专利技术的重组耐热植酸酶。相应地，本专利技术提供了从本专利技术的转化植物细胞分离的耐热植酸酶，以及合成制备的酶。通过本专利技术方法制备的融合多肽优选包含信号序列。该信号序列，可操纵性地和植酸酶基因相连接，将植酸酶靶向到细胞的造粉体、内质网、质外体或淀粉颗粒。示例性的信号序列包括但不局限于蜡质基因的N末端序列、γ-玉米醇溶蛋白的N末端序列，淀粉结合结构域，如蜡质基因淀粉结合结构域。在一个优选的实施方案中，本专利技术方法中制备和采用的融合多肽包含SEKDEL信号序列，该信号序列和耐热植酸酶的C末端可操纵性地相连接。本专利技术提供的耐热植酸酶在pH大于2.0、小于4.0的条件下半衰期超过25分钟。本专利技术进一步提供的是耐热植酸酶、植酸酶制剂或酶混合制剂的配制方法。重组耐热植酸酶或其制剂以补充剂的形式添加到食物或动物饲料中，或在食物或动物饲料加工过程之前、加工过程中或加工之后加到食物及饲料的组分中。优选的是，本专利技术的重组耐热植酸酶在制粒机中的热(如蒸汽)条件之前和/或过程中添加到饲料组分的混合物中。因此，本专利技术包括制备和使用耐热植酸酶的方法。另外，由于本专利技术的植酸酶能够耐受饲料配制过程中商用制粒机中的热条件，本专利技术提供了制备动物饲料，如包含耐热植酸酶的硬颗粒饲料颗粒的方法。为了制备饲料，可以将配制好的植酸酶和饲料组分相混合，在制粒机中形成混合物蒸汽条件，使其保留至少50％热处理前的酶活性，然后饲料压榨通过颗粒着色(pellet dye)。除了和维生素、矿物质、其他饲料酶、农业副产品(如麦麸或玉米麸片)或其组合一起使用之外，植酸酶自身也可以用作动物饲料补充剂。该酶还可以添加到糊状食物中，如没有粒化的食物。由于目前能够购买到的植酸酶不是耐热的，它们经常在粒化之后应用，通常通过将酶溶液喷洒本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备耐热植酸酶的方法，包括：在植物细胞中表达一种表达盒，该表达盒包含和编码耐热植酸酶的核酸分子可操纵性相连接的启动子，其中耐热植酸酶于６０℃下３０分钟后仍保留至少４０％活性，在ｐＨ４．５、３７℃条件下比活超过２００Ｕ／ｍｇ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：MB拉纳汉，S贝茨，
申请(专利权)人：先正达公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]