添加在饲料中植酸酶的微量测定方法技术

本发明专利技术公开了一种添加在饲料中植酸酶活性的微量测定方法。该方法首先，用乙酸缓冲液Ｉ作为透析外液对样品进行透析处理，降低饲料中无机磷含量，以消除饲料中的无机磷对植酸酶水解反应的影响；其次，在反应时取待反应液体积１ｍｌ代替现有方法中的０．２ｍｌ，加１ｍｌ乙酸缓冲液Ｉ代替现有方法的１．８ｍｌ乙酸缓冲液Ｉ，使样品空白的吸光值落在一个合理的测定范围内，以避免因样品空白中无机磷含量过高而引起测定的误差；第三，在饲料中添加已知酶，通过测定已知酶，检验已知酶在样品提取、透析、测定过程中是否有损失。本发明专利技术能够准确测定添加在饲料中植酸酶含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种添加在词料中植酸酶的微量测定方法。
技术介绍
一、植酸酶在饲料中的应用及其测定方法近年来，随着畜禽养殖业的发展和磷资源的消耗，磷酸氢钙价格连年攀升，已成为继蛋白质和能量之后又一大饲料原料；另一方面，饲料中添加大量无机磷也加剧了环境污染。因此，利用微生物植酸酶减少日粮中的磷酸氢钙用量越来越受到人们的青睐。目前，植酸酶产品的种类与剂型繁多，确定科学的植酸酶以及添加到饲料后，质量检测与评判方法，对选择质优价廉的植酸酶产品尤为重要。植酸酶检测方法最初由德国巴斯夫公司推出，1个植酸酶活性单位定义为在37°C和pH为5.5的条件下每分钟从浓度为0.005 mol/1的植酸钠溶液中释放出lpmol无机磷所需要的植酸酶的数量。2002年，在这一定义的基础上，起草了饲用植酸酶活性测定方法的国家标准。标准适用于作伺料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料，样品最低检出量为90U/kg。植酸酶的基因片段一些来源于大肠杆菌，而另外一些商品植酸酶则来源于曲霉。大量的植酸酶分离纯化后性质鉴定表明，不同来源的植酸酶在分子量、等电点、最适温度和pH值上都有着明显的不同，并且在对底物的选择性上也有区别。来源于曲霉的植酸酶检测方法已于2002年正式发布(GB/T18634~2002)，但因为不同来源的植酸酶作用位点、最佳pH等均不同，用GB/T18634—2002测定来源于大肠杆菌的植酸酶，检测结果变异系数较大，无法准确测定，因此，需要有一种快速、简便，具有高度特异性、灵敏度、准确度的方法，测定植酸酶的活性以及添加在词料中的植酸酶的活性，将会更有利于科学合理地制作配方，促进植酸酶产业的发展。二、 目前现有技术测定配合(全价)饲料中植酸酶样品的问题 (一)、加酶饲料中植酸酶活性测定的问题1、 加酶饲料中酶活测定的问题之一酶的活性是测定其底物或产物的变化量，但是酶降解的底物或生成的 产物，在饲料中本身就存在，而且存在的量很大，其数量是酶引起的变化量 的好多倍。在酶活测定时饲料中本来存在的大量底物或产物也会引起显色反应， 对酶制剂引起的显色反应构成干扰，所以属于酶活测定的杂质。由于饲料中本来存在的底物或产物量更大，会引起更深的显色反应，其所引起的吸光度变化值会远大于酶促反应底物显色所引起的吸光度值的变 化。所以，加酶词料中酶活检测的第一个问题存在的杂质(本底)干扰。2、 加酶词料中酶活测定的问题之二酶制剂加入饲料后，1000 10，000倍的稀释，使得饲料中酶制剂的活性， 低于可测的活性底线。这是加酶饲料中酶活测定的第二个问题活性太低的 问题。加酶饲料中酶的微量测定技术的关键之二是设法浓縮酶的浓度，或 采用常用比色法以外灵敏度更高的测定方法。3、 其它问题(1) 酶与词料中的某些成分的亲和性，导致酶的溶解不全，引起测定的 误差。最典型的例子是某些来源的植酸酶。(2) 词料中的少量内源酶对外源酶的干扰，等等。三、 目前现有技术测定配合(全价)饲料中植酸酶样品的缺点现有测定方法(GB/T 18634-2002)中，"钼黄法"测定植酸酶含量的原理 为植酸酶在一定温度和pH条件下，水解植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生 物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的 复合物，在波长415nm下进行比色测定。具体过程为取待反应液(酶浓度 约0.4U/ml) 0.2ml，加入1.8ml 0.25mol/l的pH5.0乙酸缓冲液，37。C水浴预 热5分钟，加入已预热至37°(3的7.5mmo1/1的植酸钠溶液4ml， 37'C精确水解 30分钟，加入4ml颜色终止液(1份100g/l钼酸铵溶液+1份2.35g/L偏钒酸 铵溶液+2份l: 2水溶液的硝酸溶液)，反应后室温下静置10分钟，4000rpm7离心10分钟。上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nrn波长处 测定样品空白和样品溶液的吸光值，根据实测吸光值计算植酸酶的活性。该方法用于测定植酸酶样品，相对较为准确。但是，用于测定添加在饲 料中的植酸酶，该方法检测下限为2.0U/g饲料，而实际饲料中的植酸酶酶活 约为0.5U/g饲料，远远低于该方法的检测下限。另外，饲料中无机磷含量远 高于反应生成的无机磷量，影响植酸酶与底物的反应。样品空白吸光值超出 测定范围。四、现有技术测定配合(全价)饲料中植酸酶样品的结果 目前，植酸酶制剂在畜禽饲料生产中已得到广泛应用，但饲料中植酸酶 活性的测定方法还存在一些争议。2002年，国家颁布了饲用植酸酶活性的测 定方法标准(GB/T 18634-2002)，该标准注明其适用于词料添加剂用的植酸酶 产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓縮饲料和添加剂预混合饲料。 但配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料成分显然更为复杂，其适用性受 到质疑。使用该方法测定"添加在饲料中的植酸酶活性"，结果相对偏差较大， 变异系数较大。下表所示是用标准(GB/T 18634-2002)方法测定加酶词料中植 酸酶活性的一些实验数据加酶饲料样品中植酸酶活性测定(U/g)<table>table see original document page 8</column></row><table><table>table see original document page 9</column></row><table>由上述测定结果可知，该方法直接测定配合饲料或浓縮料中的植酸酶活性，变异系数较高(13%—20%)，有时甚至更高，因此，本方法用于测定配合 饲料或浓缩料中的植酸酶活性时，相对偏差在20%，测定结果误差较大。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够准确测定添加在饲料中植酸 酶活性的微量测定方法。本专利技术所采用的技术方案是本专利技术所述添加在饲料中植酸酶的微量测 定方法，其步骤如下(1)试剂和溶液的配制(U ) 乙酸缓冲液(I )， c (CH3COONa)=0.25mol/l:称取34.02g三水 乙酸钠于1000ml烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至 5.00±0.01,再转移至lOOOmL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室温下存 放2个月内有效；(1.2) 乙酸缓冲液(II)， c (CH3COONa)=0.25mol/l:称取34.02g三水 乙酸钠，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml烧杯中，加入900mL水搅拌 溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00士0.01,再转移至1000ml容量瓶中，并用蒸 馏水定容至刻度；室温下存放2个月内有效；(1.3) 植酸钠溶液(C6H6024P6Na,2)为7.5mmol/l:称取0.6929g植酸钠 (C6H6024P6Na12，相对分子质量为923.8，纯度为95%)，精确至O.lmg，置于 100ml烧杯中，用约80ml乙酸缓冲液(I)溶解，用冰乙酸调节pH值至 5.00土0.01，转移至100ml容量瓶中，并用乙酸缓冲液(I)定容至刻度，现用 现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/l);(1.4) 硝酸溶液l份浓硝酸+2份水；(1.5) 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种添加在饲料中植酸酶的微量测定方法，特征在于，其步骤如下：　（１）试剂和溶液的配制　（１．１）乙酸缓冲液（Ⅰ），ｃ（ＣＨ↓［３］ＣＯＯＮａ）＝０．２５ｍｏｌ／ｌ：称取３４．０２ｇ三水乙酸钠于１０００ｍｌ烧杯中，加入９００ｍｌ水搅拌溶解，用冰乙酸调节ｐＨ值至５．００±０．０１，再转移至１０００ｍｌ容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室温下存放２个月内有效；　（１．２）乙酸缓冲液（Ⅱ），ｃ（ＣＨ↓［３］ＣＯＯＮａ）＝０．２５ｍｏｌ／ｌ：称取３４．０２ｇ三水乙酸钠，０．５ｇ牛血清白蛋白（ＢＳＡ）于１０００ｍｌ烧杯中，加入９００ｍｌ水搅拌溶解，用冰乙酸调节ｐＨ值至５．００±０．０１，再转移至１０００ｍｌ容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室温下存放２个月内有效；　（１．３）植酸钠溶液（Ｃ↓［６］Ｈ↓［６］Ｏ↓［２４］Ｐ↓［６］Ｎａ↓［１２］）为７．５ｍｍｏｌ／Ｌ：称取０．６９２９ｇ植酸钠（Ｃ↓［６］Ｈ↓［６］Ｏ↓［２４］Ｐ↓［６］Ｎａ↓［１２］，相对分子质量为９２３．８，纯度为９５％），精确至０．１ｍｇ，置于１００ｍｌ烧杯中，用约８０ｍｌ乙酸缓冲液（Ⅰ）溶解，用冰乙酸调节ｐＨ值至５．００±０．０１，转移至１００ｍｌ容量瓶中，并用乙酸缓冲液（Ⅰ）定容至刻度，现用现配（实际反应液中的最终浓度为５．０ｍｍｏｌ／ｌ）；　（１．４）硝酸溶液：１份浓硝酸＋２份水；　（１．５）钼酸铵溶液，１００ｇ／ｌ：称取１０ｇ钼酸铵［ＮＨ↓［４］）↓［６］Ｍｏ↓［７］Ｏ↓［２４］.４Ｈ↓［２］Ｏ］于５０ｍｌ烧杯中加水溶解，再转移至１００ｍｌ容量瓶中，加入１．０ｍｌ氨水（２５％）用水定容至刻度；　（１．６）偏钒酸铵溶液，２．３５ｇ／ｌ：称取０．２３５ｇ偏钒酸铵（ＮＨ↓［４］ＶＯ↓［３］）于５０ｍｌ烧杯中，加入２ｍｌ硝酸溶液及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，再转移至１００ｍｌ棕色容量瓶中，用水定容至刻度；避光条件下保存；　（１．７）颜色终止液：取２份硝酸溶液，１份钼酸铵溶液，１份钒酸铵溶液混合使用，现用现配；　（１．８）标准植酸酶（标明准确活性单位和类型）；　（２）测定　（２．１）标准曲线　准确称取一定量的标准植酸酶，精确至０．０００１ｇ，于５０ｍｌ容量瓶中，用乙酸缓冲液（Ⅱ）溶解并定容至刻度，做两次稀释，使植酸酶活性为０．３０Ｕ／ｍｌ左右，当日配制；　将上述植酸酶按表１用缓冲液（Ⅱ）进行稀释，需要准确计算植酸酶的浓度，与样品一起反应测定，以植酸酶浓度为横坐标，...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：史宝军，陈丽芝，崔细鹏，刘金山，
申请(专利权)人：广东溢多利生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]