脂肪油中有效成分的一种测定方法技术

本发明专利技术公开了脂肪油中有效成分的一种测定方法，该方法采用柱前衍生反相ＨＰＬＣ法，简化了样品衍生化操作步骤，无需萃取，节省时间和试剂，衍生化反应完全，采用适当的色谱分离条件，将目的组分与杂质完全基线分离。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
海狗系深海哺乳动物，生活在北极圈以内-50℃的高寒水域中，以名贵的鳕鱼为食，皮下有厚厚的脂肪层，体内富含ω-3多烯脂肪酸。以加拿大北部无污染海域海狗脂肪为原料提炼出的海狗脂肪油，其中含有三种重要的ω-3多烯脂肪酸-EPA(Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸)、DPA(Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸)和DHA(Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸)，且总含量在20％以上。医学界经过多年的研究已经证实，这三种脂肪酸对人体有多种独特的生物学活性EPA具有改善血液循环、软化血管、调整血脂、降低血压和血糖以及抗炎作用；DHA和DPA具有营养大脑、促进胎儿和儿童大脑发育、保护视力、调节免疫和抗癌作用，其中DHA又被称作“脑黄金”。近期人们又发现它们对一些疾病具有治疗作用EPA已被开发作为治疗动脉硬化和高血脂的药物；还发现海狗油对II型糖尿病、脂肪肝和前列腺炎具有治疗和预防作用。人体自身不能合成ω-3多烯脂肪酸，只能从外界摄取，深海冷水鱼油中虽然也还有ω-3多烯脂肪酸，但其与海狗油相比除含量一般较低外，还有以下重大区别1.海狗与人类同为哺乳类动物，其体内甘油脂的化学结构与人类相似，ω-3多烯脂肪酸一般位于甘油三脂的1、3位，而鱼是低级冷血动物，ω-3多烯脂肪酸位于甘油三脂的2位，要经过人体肝脏代谢后才能利用。因此海狗油的ω-3多烯脂肪酸相比之下有更好的生物利用度，且不会增加肝脏负担。2.海狗油中还含有2-3％的角鲨烯，这也是鱼油中没有的，这种物质有效抑制生物中不良胆固醇的吸收并加速其代谢，还具有防癌作用，另外对皮肤也有滋润作用。3.海狗油中不仅富含EPA和DHA，并且富含DPA，而大多数鱼油中DPA含量很低。4.海狗油中几乎不含胆固醇，而大多数鱼油却含有较多胆固醇。因此，海狗油相对于鱼油具有更高的应用价值，可帮助人们战胜糖尿病、脂肪肝、冠心病等长期困扰人类的“现代文明病”。海狗油等脂肪油中脂肪酸的含量测定多采用柱前衍生毛细管气相色谱法，近年来HPLC测定法由于其外标定量准确、方法重现性良好、有足够的分离度、仪器相对比较普及，并可以为中低压液相制备提供依据等独特的优点而越来越受到重视。脂肪油的碱催化转酯化方法国内外均有文献报道，但现有的操作步骤均较繁琐，衍生后需进行多次萃取，处理时间长，且耗费大量有机溶剂，所以此方法还需进一步改进。对于海狗油来说，采用衍生方法中脂肪油的碱催化转酯化方法，操作步骤繁琐，要求衍生后进行多次萃取，再合并萃取液用无水硫酸钠干燥，最后减压吹干萃取剂再定容。按此步骤操作，每处理一个样品约需4-6小时，费时费力，且浪费大量有机溶剂，不利人体健康，也破坏了环境。而且采用传统样品衍生方法，回收率低，仅83.6％左右，衍生化试剂也需现用现配，给操作带来不便。因此目前海狗油等脂肪油中有效成分的测定方法还需进一步改进，才能更为准确地测定脂肪油中的有效成分EPA、DHA和DPA的含量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，该方法采用柱前衍生反相HPLC法，简化了样品衍生化操作步骤，无需萃取，节省了时间和试剂，能保证完全酯化的衍生条件，采用适当的色谱分离条件，将目的组分与杂质完全基线分离。本专利技术的另一目的在于提供海狗油中有效成分的一种测定方法。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供，包括以下步骤1)脂肪油的衍生化处理取脂肪油与含0.2-1.0mol/L醇的碱金属盐以1∶30-100体积比混合摇匀，在0-60℃下反应至小油滴完全消失，再加入酸终止反应，用醇定容，过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液；2)色谱进样分析取衍生处理后的脂肪油，进入液相色谱仪，所述的色谱仪的色谱条件为流动相甲醇水系统、乙腈四氢呋喃水系统或乙腈甲醇水系统，等梯度洗脱， 流速1.1-1.5ml/min，柱温15-45℃，检测波长202～230nm，进样量5～50μl；3)记录色谱图，用外标法测定脂肪酸的含量。其中，所述的脂肪油为鱼油、植物油或海狗油等含有三种多烯脂肪酸EPA、DPA和DHA的脂肪油，所测定脂肪油中的有效成分是指三种ω-3多烯脂肪酸EPA-Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸；DPA-Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸和DHA-Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸，本方法可测定这三种脂肪酸中的一种或多种。本方法尤其适合海狗油中这三种ω-3多烯脂肪酸的测定。其中，步骤1)脂肪油的衍生化处理取脂肪油80-120μl，加入0.2-1.0mol/L醇的碱金属盐4-8ml，摇匀，在0-60℃下反应至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml酸终止反应，用醇定容，0.2μm-0.3μm滤膜过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液。进一步地说，所述的衍生化处理方法为取脂肪油100-120μl，加入0.5-0.8mol/L的甲醇钠4-6ml，摇匀，室温反应15-30分钟，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸终止反应，用甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液。衍生化反应中所述的醇的碱金属盐可为甲醇钠、乙醇钠或甲醇钾等，优选为甲醇钠，甲醇钠在15天以内催化衍生化能力基本无变化。其浓度为0.2-1.0mol/L，优选为0.5-0.8mol/L。终止反应所用的酸为冰醋酸、甲酸、三氟乙酸或硫酸等中的任意一种，定容所用的醇为甲醇、乙醇等。为了使产品具有更好的稳定性，定容时可加0.001％-0.005％的抗氧化剂，所述的抗氧化剂为2，6-二叔丁基对甲酚或对羟基叔丁基茴香醚。优选的，本专利技术所述的衍生化处理在0-60℃下反应5-30分钟，为了便于操作，衍生化反应更优选在室温下进行，反应15分钟。本专利技术色谱仪所用的色谱柱可为Allsphere Octyl(C8)，3μm，100，4.6mm×150mm；Waters SymmetryShield RP-18，5μm，100，3.9mm×150mm和LichrospherRP-18，5μm，100，4.6mm×250mm。以RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型号为好。如Waters高效液相色谱仪，Lichrospher高效液相色谱仪，Mightsil高效液相色谱仪。优选的，液相色谱仪为RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型号。在选择色谱仪的色谱条件时，发现检测波长在202～230nm之间均可，其中210nm处三种脂肪酸吸收较强且稳定，精密度也符合药典要求，故检测波长选用210nm为佳。本专利技术选择甲醇水系统、乙腈四氢呋喃水系统或乙腈甲醇水系统三种系统中的任意一种作为流动相进行等梯度洗脱。经反复调试，改变比例，最终发现乙腈甲醇水系统最好，在其比例为7∶1∶2流速逐渐提高至1.1-1.5ml/min，最后发现在流速为1.2ml/min时各项指标达到最佳。所以流动相优选为乙腈甲醇水系统，三者比例为7∶1∶2，流速为1.2ml/min，同时柱温选择在15-45℃。为实现本专利技术的另一目的提供海狗油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，包括以下步骤1)海狗油的衍生化处理取海狗油80-120μl，本文档来自技高网...

【技术保护点】
脂肪油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，包括以下步骤：１）脂肪油的衍生化处理：取脂肪油与含０．２－１．０ｍｏｌ／Ｌ醇的碱金属盐以１∶３０－１００体积比混合摇匀，在０－６０℃下反应至小油滴完全消失，再加入酸终止反应，用醇定 容，过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液；２）色谱进样分析取衍生处理后的脂肪油，进入液相色谱仪，所述的色谱仪的色谱条件为：流动相：甲醇水系统、乙腈四氢呋喃水系统或乙腈甲醇水系统，等梯度洗脱，流速：１．１－１． ５ｍｌ／ｍｉｎ，柱温：１５－４５℃，检测波长：２０２～２３０ｎｍ，进样量：５～５０μｌ；３）记录色谱图，用外标法测定脂肪酸的含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐康森，王召，乐嘉静，李湛君，
申请(专利权)人：中国药品生物制品检定所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]