荚膜组织胞浆菌变态反应原的提取方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种荚膜组织胞浆菌变态反应原的提取方法，该方法采用液体表面培养方式培养荚膜组织胞浆菌，经高压蒸汽处理后过滤去除菌体，用盐析和弱酸沉淀分步提取的方法提取荚膜组织胞浆菌变态反应原。该方法工艺简单，蛋白纯度高，获得的荚膜组织胞浆菌变态反应原可用于诊断人体荚膜组织胞浆菌的感染以及荚膜组织胞浆菌病和结核病的鉴别诊断，有较高的敏感性、特异性和安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白的提取方法，具体涉及一种荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)变态反应原的提取方法，以及所提取的变态反应原在诊断人体荚膜组织胞浆 菌的感染以及鉴别荚膜组织胞浆菌病和结核病中的用途。
技术介绍
荚膜组织胞浆菌属于真菌界一半知菌亚门一丝孢菌纲一丛梗孢目一丛梗 孢科，是一种双相型真菌，在37°C血培养时为酵母型、在室温培养时为典型的菌丝体。荚膜 组织胞浆菌可引起一种原发型呼吸系统真菌病一荚膜组织胞浆菌病，在全世界30多个 温带和热带国家流行。由于该病发病类型多样，临床上极易误诊为结核病、肺炎、结节病、 败血症等，尤其慢性肺型荚膜组织胞浆菌病的临床表现为发热、全身不适、咳嗽、咳痰、咯 血、胸痛、呼吸困难、盗汗、消瘦，患者肺部早期呈肺炎样改变，后期可有空洞形成，胸片主要 表现为假阳性致密浸润，以肺尖及上叶后段最为多见，上述表现与结核病难以鉴别，而且有 10 15%患者同时患肺结核病。我国的江苏、北京、广西、上海，山东、湖南等省均有荚膜组织胞浆菌病的病例报 导，可查病例中约1/3被误诊为结核病。以美国荚膜组织胞浆菌素(Histoplasmin)在我国 湖南进行的组织胞浆菌病调查中，健康人群感染率约为8. 3%，据此推测我国有近1亿人感 染该菌；在湖南长沙对住院结核病患者调查的结果表明，具有结核病临床表现而结核菌细 菌学检查阴性者的荚膜组织胞浆菌素阳性检出率高达33. 61%，这应引起对荚膜组织胞浆 菌病的高度重视。由于荚膜组织胞浆菌病与结核病临床症状极其相近，而在我国440万“结 核病患者”中2/3细菌学检查为阴性，主要根据临床体征与X线胸片判为结核。根据上述 “结核病患者”中荚膜组织胞浆菌素高阳性率的流调结果推测，部分“结核病患者”可能是胞 浆菌病患者的误诊。综上所述，对荚膜组织胞浆菌病和结核病的鉴别诊断极为重要，但由于我国临床 医生对该病了解甚少，加上缺乏荚膜组织胞浆菌病诊断制品，造成我国多数荚膜组织胞浆 菌病患者被误诊。因此研制荚膜组织胞浆菌病诊断制剂对解决目前国内大量结核病与荚膜 组织胞浆菌病误诊、漏诊的状况十分必要。目前在诊断荚膜组织胞浆菌病中使用最广泛、历史最悠久的制品是荚膜组织胞 浆菌素，该制品类似于旧结核菌素，由荚膜组织胞浆菌滤液制备而成(该方法由Emmons 氏于1945年建立，由荚膜组织胞浆菌在液体天冬素培养基22°C静置培养8周后，离心 3000rpm去除菌体，经过滤除菌，过滤后滤液经1 100稀释而成)(Emmons, C. W.，Olson, B. J. , and Eldridge, W. W. :Studies of the role of fungi in pulmonary disease. I. Crossreactions of histoplasmin, Public Health Rep, 1945,60,1383.)。皮肤迟发型变态反应类制剂如结核菌素、布氏菌素等均经历了由菌体培养滤液制剂到提取变态反应蛋 白的换型过程，而荚膜组织胞浆菌素目前仍然是由滤液制备的制品。该制品含培养基成分 而且菌体杂质较高，容易引起非特异性反应；无法以化学定量法测定有效物质含量，只能以 致敏动物标化确定效价，难以得到精确的结果，量效关系难以等同，而且结果受动物致敏状 态、注射部位的影响；非纯化制品以及滤液残留物易引起较强的副反应，产生大红肿、硬结、 水泡等现象。在国外，已有制备菌体组织胞浆菌素的报道(Levine，H.B. ,Scalarone,G. Μ.， Campbell, Guy D. :Histoplasmin_CYL, a yeast phase reagent in skin test studies with Human, American Review of Respiratory Disease, 1979,119,629.),该方法为将合 成培养基上培养物离心收集，经洗涤后加入蒸馏水振荡M小时，过滤收集上清液应用于皮 试；其剂量14. 5yg相当于FDA 1 100荚膜组织胞浆菌素(国际参考品)剂量。但由于 该制品仍未以化学方法提纯，造成其灵敏度与特异性均不理想。引起皮肤变态反应的变态反应原为热稳定性蛋白，通常用于提取蛋白的方法均可 用于菌素的提取与纯化。目前所报道的方法主要有硫酸铵沉淀法、三氨醋酸纯化法、醋酸 提取法、丙酮萃取法以及乙醇提取等方法。根据多年对各种提取方法的比较研究，本专利技术确 定以盐析和弱酸沉淀分步提取的方法制备荚膜组织胞浆菌变态反应原，该方法国内外均未 见报道，其工艺简单，蛋白纯度高，用于诊断人体荚膜组织胞浆菌的感染以及荚膜组织胞浆 菌病和结核病的鉴别诊断时具有较高的敏感性、特异性和安全性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种荚膜组织胞浆菌变态反应原的提取方法，所述的方法以盐析和 弱酸沉淀分步提取的方法从荚膜组织胞浆菌培养滤液中提纯荚膜组织胞浆菌变态反应原 蛋白、以化学定量与生物定量相结合方式，制备荚膜组织胞浆菌变态反应原。具体来说，所 述的方法包括以液体表面培养方式培养荚膜组织胞浆菌、经高压蒸汽处理后过滤去除菌 体、取无菌体滤液，用盐析和弱酸沉淀法提取荚膜组织胞浆菌变态反应原。本专利技术的提取方法中所述的盐析和弱酸沉淀法包括下列步骤向无菌体培养滤液 中加入三氯醋酸，收集沉淀，经溶解后，加入硫酸铵，收集沉淀，用三氯醋酸多次洗涤，然后 将溶解的沉淀透析，透析内液经无菌过滤后得荚膜组织胞浆菌变态反应原。其中，加入的三 氯醋酸的终浓度为4%。本专利技术的提取方法中所述的液体表面培养方式是指将荚膜组织胞浆菌接种于葡 萄糖琼脂斜面培养基上，25°c培养。将斜面生长良好且无污染的菌丝体培养物接种于葡萄 糖甘油液体培养基表面，25°C静置培养8周以上。本专利技术还涉及根据上述所述提取方法制备的荚膜组织胞浆菌变态反应原及其在 诊断人体荚膜组织胞浆菌的感染以及鉴别荚膜组织胞浆菌病和结核病中的应用。以本专利技术所述方法制备的荚膜组织胞浆菌变态反应原蛋白纯度>80%，灵敏度与 特异性均高于国外同类制品(lyg纯化蛋白效力与FDAl 100荚膜组织胞浆素以及胞浆 菌菌体冻溶蛋白素14. 5 μ g剂量等效)，为荚膜组织胞浆菌变态反应原对荚膜组织胞浆菌 感染的诊断提供了理论依据；经安全性试验、异常毒性、热源实验和致敏效应试验证实本发 明制备的荚膜组织胞浆菌变态反应原是安全的。本专利技术的方法工艺简单易于标准化，获得 的荚膜组织胞浆菌变态反应原用于诊断荚膜组织胞浆菌的感染以及荚膜组织胞浆菌病和结核病的鉴别诊断有较高的敏感性、特异性和安全性。 具体实施例方式到现在为止，已经给出了本专利技术的一般性描述。借助于下列实施例，参照特定的实 施方案，以下给出更详细的说明，目的是为了更好地理解本专利技术的目的、特征、优点和操作 方法。然而，无意于将本专利技术的范围限定在此范围内。在如下实施例中，未详细描述的各种 过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1 荚膜组织胞浆菌变态反应原的制备本实施例详细说明了荚膜组织胞浆菌的液体表面膜培养技术和荚膜组织胞浆菌 变态反应原的盐析和弱酸沉淀提取方法。1. 1荚膜组织胞浆菌的液体表面膜培养将荚膜组织胞浆菌(ATCC 12700)本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种荚膜组织胞浆菌变态反应原的提取方法，其特征在于，所述的方法包括：以液体表面培养方式培养荚膜组织胞浆菌、经高压蒸汽处理后过滤去除菌体，取无菌体滤液用盐析和弱酸沉淀法提取荚膜组织胞浆菌变态反应原。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王国治，陈保文，徐苗，沈小兵，苏城，
申请(专利权)人：中国药品生物制品检定所，
类型：发明
国别省市：11