本发明专利技术公开了一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产L‑谷氨酸中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种可高产L‑谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW‑10‑ppc，将此重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW‑10‑ppc接种至5‑L发酵罐中发酵48h，即可使发酵液中L‑谷氨酸的产量高达136.09±5.53g/L、糖酸转化率高达58.9％，分别较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01提高了45.5％和13.7％。
【技术实现步骤摘要】
一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产L-谷氨酸中的应用
本专利技术涉及一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产L-谷氨酸中的应用，属于生物
技术介绍
L-谷氨酸是一种重要的氨基酸，在多个领域均具有广泛应用。例如，L-谷氨酸具有较浓的鲜味，可作为调味剂应用于食品行业；L-谷氨酸可用于合成表面活性剂，在化妆品领域具有重要的应用；L-谷氨酸被人体吸收后，易与血氨形成谷酰胺，能解除代谢过程中氨的毒害作用，可作为肝脏病患者的辅助药物在医药领域具有重要的应用，并且，L-谷氨酸作为神经中枢及大脑皮质的补剂，对于治疗脑震荡或神经损伤、癫痫以及对弱智儿童均有一定疗效。L-谷氨酸的生产方法主要包括蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法这三种，其中，蛋白水解法具有操作复杂、费时费力、成本高和产物产量低等缺陷，化学合成法则存在严重的环境污染问题，因此，两者都不适合大规模的生产。与蛋白水解法和化学合成法相比，利用微生物发酵法生产L-谷氨酸具有环境友好、条件温和、成本低和易于工业化生产等优势，因此，目前工业上常利用微生物发酵法生产L-谷氨酸。但是，现有的微生物发酵法仍具有一定缺陷，其中，产量低是限制L-谷氨酸的工业化生产进程的缺陷之一。例如，王楠楠等人将重组菌株SNW201接种至发酵培养基中发酵48h，仅可使发酵液中L-谷氨酸的产量达46.7g/L(具体可见参考文献：Wang,N.,Ni,Y.,Shi,F.,DeletionofodhAorpycimprovesproductionofgamma-aminobutyricacidanditsprecursorL-glutamateinrecombinantCorynebacteriumglutamicum.BiotechnolLett.2015,37,1473-1481.)；鲍杰等人将C.glutamicumXW6菌株接种至发酵培养基中发酵48h，仅可使发酵液中L-谷氨酸的产量达65.2g/L(具体可见参考文献：Jingbai,Wen,Jie,etal.EngineeringCorynebacteriumglutamicumtriggersglutamicacidaccumulationinbiotin-richcornstoverhydrolysate.[J].Biotechnologyforbiofuels,2019.)；吴新世等人将LG-01接种至发酵培养基中发酵48h，仅可使发酵液中L-谷氨酸的产量达106.10g/L(具体可见参考文献：吴新世,王楠,彭湲,等.一株产谷氨酸菌株的复合诱变选育及突变株的生物学特性[J].天津理工大学学报,2012,28(1):83-88.)。因此，急需找到一种可高产L-谷氨酸的L-谷氨酸生产菌株以克服现有微生物发酵法缺陷。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种可高产L-谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌。[技术方案]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲弱编码α-酮戊二酸复合体E3亚基的基因lpd，且表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc。在本专利技术的一种实施方式中，所述α-酮戊二酸复合体E3亚基的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码α-酮戊二酸复合体E3亚基的基因lpd的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)G01为宿主，敲弱编码α-酮戊二酸复合体E3亚基的基因lpd，且以pJYW-4质粒、pEC-XK99E质粒或pDXW-10质粒为载体表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc。本专利技术还提供了一种生产L-谷氨酸的方法，所述方法为先将上述重组谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有L-谷氨酸的发酵液，然后将含有L-谷氨酸的发酵液进行分离，获得L-谷氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为28～31℃、转速为500～600rpm、pH为7.0～7.2。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为30℃、转速为600rpm、pH为7.0。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖120～150g/L、三水合磷酸氢二钾1.0～1.5g/L、七水合硫酸镁0.2～0.6g/L、玉米浆2.5～5.0g/L、七水合硫酸亚铁0.005～0.008g/L、一水合硫酸锰0.005～0.008g/L以及尿素5.5～7.0g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖140g/L、三水合磷酸氢二钾1.5g/L、七水合硫酸镁0.6g/L、玉米浆5.0g/L、七水合硫酸亚铁0.005g/L、一水合硫酸锰0.005g/L以及尿素7.0g/L。本专利技术还提供了上述重组谷氨酸棒杆菌或上述方法在生产L-谷氨酸中的应用。[有益效果]本专利技术提供了一种可高产L-谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumDL01/pDXW-10-ppc，将此重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumDL01/pDXW-10-ppc接种至5-L发酵罐中发酵48h，即可使发酵液中L-谷氨酸的产量高达136.09±5.53g/L、糖酸转化率高达58.9％，分别较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)G01提高了45.5％和13.7％。附图说明图1：敲弱质粒pFSC-dCas9-S3的构建示意图。图2：不同谷氨酸棒杆菌发酵获得的发酵液中α-酮戊二酸复合体E3亚基LDP的酶活水平。图3：不同谷氨酸棒杆菌的编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc的转录水平。图4：不同谷氨酸棒杆菌的菌落PCR验证结果；其中，M为10000bp核酸Marker，1～2为重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumDL01，泳道条带为dCas9-Ptrc-S3融合片段。图5：不同谷氨酸棒杆菌发酵获得的发酵液的菌体量。图6：不同谷氨酸棒杆菌发酵获得的发酵液中L-谷氨酸的产量。图7：不同谷氨酸棒杆菌发酵获得的发酵液中葡萄糖的含量。图8：不同谷氨酸棒杆菌的菌落PCR验证结果；其中，M为10000bp核酸Marker，1～2为重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumG01/pDXW-10-ppc，泳道条带为ppc基因。图9：不同谷氨酸棒杆菌发酵获得的细胞破碎上清液的凝胶电泳图；其中，M为蛋白Marker，1为重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumG01，2为重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumG01/pDXW-10-ppc。具体实施方本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲弱编码α-酮戊二酸复合体E3亚基的基因lpd，且表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc。/n
【技术特征摘要】
1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲弱编码α-酮戊二酸复合体E3亚基的基因lpd，且表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc。
2.如权利要求1所述的一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述α-酮戊二酸复合体E3亚基的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。
3.如权利要求1或2所述的一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。
4.如权利要求1-3任一所述的一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)G01为宿主，敲弱编码α-酮戊二酸复合体E3亚基的基因lpd，且以pJYW-4质粒、pEC-XK99E质粒或pDXW-10质粒为载体表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc。
5.一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有L-谷氨酸的发酵液，然后将含有L-谷氨酸的发酵液进行分离，获得L-谷氨酸。
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【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，乔郅钠，徐美娟，龙梦飞，杨套伟，张显，邵明龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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