用于丁二烯生物合成的微生物和方法技术

本发明专利技术提供具有生产巴豆醇的生物合成途径或丁二烯途径的非天然存在的微生物。本发明专利技术还提供使用这种生物来生产巴豆醇或丁二烯的方法。

【技术实现步骤摘要】
专利技术背景本专利技术一般地涉及生物合成过程，更具体地涉及具有丁二烯生物合成能力的生物。每年都有超过250亿磅的丁二烯(1,3-丁二烯，BD)生产出来并应用于聚合物(例如合成橡胶和ABS树脂)和化学品(例如己撑二胺和1,4-丁二醇)的制造中。丁二烯通常作为水蒸汽裂解过程的副产物而产生，所述水蒸汽裂解过程用于将石油原料(例如石脑油、液化的石油气体、乙烷或者天然气)转化为乙烯及其他烯烃类。在追求更加可持续的化学品生产工艺过程中，从替代和/或可再生原料制造丁二烯的能力将是一个重大的进步。可再生地生产丁二烯的一种可能方式涉及糖或其它原料的发酵，以产生二醇，如1,4-丁二醇或1,3-丁二醇，所述二醇在涉及基于金属的催化作用的第二步骤被分离、纯化，然后脱水形成丁二烯。从可再生原料直接发酵生产丁二烯便无须脱水步骤以及丁二烯气体(沸点-4.4℃)将连续地从发酵罐中射出并易于冷凝和收集。开发发酵生产工艺将消除对基于化石的丁二烯的需要，以及将允许大量节省成本和能源并减少有害废物和排放，与石化衍生的丁二烯形成对照。本文描述了用于有效地从衍生自生物质(包括农业和木材废料)的廉价的可再生原料(如糖蜜、甘蔗汁和糖)以及C1原料(如合成气和二氧化碳)生产丁二烯的微生物和方法，所述微生物和方法包括相关的优点。专利技术概述本专利技术提供包含丁二烯途径的非天然存在的微生物，其包括编码丁二烯途径酶的以足以生产丁二烯的量表达的至少一种外源性核酸。此外，本专利技术提供通过在各种条件下以及在足以生产丁二烯这么长的时间内培养如本文所述的包含丁二烯途径的非天然存在的微生物，利用这类微生物生产丁二烯的方法。附图说明图1显示出通往异戊间二烯化合物和萜烯的天然途径。用于将确认的底物转化为产品的酶包括：A.乙酰基-CoA:乙酰基-CoA酰基转移酶、B.羟甲基戊二酰基-CoA合酶、C.3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(醇形成)、D.甲羟戊酸激酶、E.磷酸甲羟戊酸激酶、F.二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、G.异戊基-二磷酸异构酶、H.异戊二烯合酶。图2显示出经由巴豆醇从乙酰基-CoA、戊烯二酰基-CoA、戊二酰基-CoA、3-氨基丁酰基-CoA或者4-羟基丁酰基-CoA生产丁二烯的示例性途径。用于将确认的底物转化为产品的酶包括：A.乙酰基-CoA:乙酰基-CoA酰基转移酶；B.乙酰乙酰基-CoA还原酶；C.3-羟基丁酰基-CoA脱水酶；D.巴豆酰基-CoA还原酶(醛形成)；E.巴豆醛还原酶(醇形成)；F.巴豆醇激酶；G.2-丁烯基-4-磷酸激酶；H.丁二烯合酶；I.巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶、转移酶；J.巴豆酸酯还原酶；K.巴豆酰基-CoA还原酶(醇形成)；L.戊烯二酰基-CoA脱羧酶；M.,戊二酰基-CoA脱氢酶；N.3-氨基丁酰基-CoA脱氨酶；O.4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；P.巴豆醇二磷酸激酶。图3显示出从赤藓糖-4-磷酸生产丁二烯的示例性途径。用于将确认的底物转化为产品的酶包括：A.赤藓糖-4-磷酸还原酶、B.赤藓醇-4-磷酸胞苷酰转移酶、C.4-(胞啶5'-二磷酸)-赤藓醇激酶、D.赤藓醇2,4-环二磷酸合酶、E.1-羟基-2-丁烯基4-二磷酸合酶、F.1-羟基-2-丁烯基4-二磷酸还原酶、G.丁烯基4-二磷酸异构酶、H.丁二烯合酶、I.赤藓糖-4-磷酸激酶、J.赤藓糖还原酶、K.赤藓醇激酶。图4显示出从丙二酰基-CoA和乙酰基-CoA生产丁二烯的示例性途径。用于将确认的底物转化为产品的酶包括：A.丙二酰基-CoA:乙酰基-CoA酰基转移酶、B.3-氧代戊二酰基-CoA还原酶(酮还原)、C.3-羟基戊二酰基-CoA还原酶(醛形成)、D.3-羟基-5-氧代戊酸还原酶、E.3,5-二羟基戊酸激酶、F.3H5PP激酶、G.3H5PDP脱羧酶、H.丁烯基4-二磷酸异构酶、I.丁二烯合酶、J.3-羟基戊二酰基-CoA还原酶(醇形成)、K.3-氧代戊二酰基-CoA还原酶(醛形成)、L.3,5-二氧代戊酸还原酶(酮还原)、M.3,5-二氧代戊酸还原酶(醛还原)、N.5-羟基-3-氧代戊酸还原酶、O.3-氧代-戊二酰基-CoA还原酶(CoA还原和醇形成)。化合物缩写包括：3H5PP＝3-羟基-5-磷酰氧基戊酸和3H5PDP＝3-羟基-5-[羟基(膦酰氧基)磷酰基]氧基戊酸。专利技术详述本专利技术旨在设计和生产具有丁二烯生物合成生产能力的细胞和生物。本专利技术具体地涉及通过引入一种或者多种的编码丁二烯途径酶的核酸设计能够生产丁二烯的微生物。在一个实施方式中，本专利技术利用大肠杆菌新陈代谢的硅内化学计量模型确认用于生物合成生产丁二烯的新陈代谢设计。本文所述的结果表明新陈代谢途径可以进行设计和重组工程以实现在大肠杆菌和其他细胞或者生物中丁二烯的生物合成。丁二烯的，例如针对硅内设计的，生物合成生产可以通过构建具有设计的新陈代谢基因型的菌株来证实。这些经过新陈代谢工程的细胞或者生物还可以经受适应性进化，以进一步增强丁二烯的生物合成，包括在接近理论最大增长量的条件下。在某些实施方式中，设计菌株的丁二烯生物合成特征使得他们具有基因稳定性以及在连续的生物工艺中极为有用。经确认，单独的菌株设计策略将不同的非原生或者异源性反应能力结合进入了大肠杆菌或者其他宿主生物，导致始自乙酰基-CoA、戊烯二酰基-CoA、戊二酰基-CoA、3-氨基丁酰基-CoA、4-羟基丁酰基-CoA、赤藓糖-4-磷酸；或者始自丙二酰基-CoA和乙酰基-CoA的丁二烯生产新陈代谢途径。经确认，硅内新陈代谢设计导致了微生物中从这些底物或者代谢中间体的每个到丁二烯的生物合成。经由平台的计算组件确认的菌株可以通过任何预测的新陈代谢改变的基因工程来投入实际生产，所述预测的新陈代谢改变导致丁二烯或者其他中间体和/或下游产品的生物合成生产。在仍然进一步的实施方式中，展示这些化合物的生物合成生产的菌株可以进一步经受适应性进化以进一步增强产品生物合成。适应性进化之后产品生物合成收率的水平也可以通过系统的计算组件来预测。从葡萄糖到丁二烯的最大理论收率是1.09mol/mol(0.33g/g)。11 C6H12O6＝12 C4H6+18 CO2+30 H2O图2和图4所示的途径中，每摩尔所用的葡萄糖收获1.0摩尔的丁二烯。如果细胞能够通过途径(例如还原的(或者逆向的)TCA循环或者Wood-Ljungdahl途径)固定CO2，提高产品收率到理论最大值便是可能的。经过工程设计以具有图3中所述的途径的生物也能够达到丁二烯收率的理论最大值的近似值。如本文所用，术语“非天然存在的”当关于本专利技术的微生物使用时，意指该微生物具有至少一种通常不会在相关物种的天然存在的菌株(包括相关物种的野生型菌株)中发现的基因改变(genetic alteration)。基因改变包括，例如，引入编码代谢多肽的可表达的核酸的修饰(modification)、其他核酸新增、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其他功能中断。这些修饰包括，例如，相关物种的异源多肽、同源多肽或异源和同源多肽的编码区和功能片段。其他修饰包括，例如，其中该修饰改变基因或操纵子的表达的非编码调控区域。示例性的代谢多肽包括在丁二烯生物合成途径内的酶或蛋白质。代谢修饰是指从其天然存在的状态发生改变的生化反应。本文档来自技高网...

【技术保护点】
非天然存在的微生物，其包括生产巴豆醇的生物合成途径，其中所述生物合成途径包括编码以足以生产巴豆醇的量表达的至少一种代谢途径酶的至少一种外源性核酸，其中所述代谢途径酶选自巴豆酰基‑CoA还原酶(醛形成)、巴豆醛还原酶(醇形成)、巴豆酰基‑CoA水解酶、合成酶或转移酶、巴豆酸酯还原酶和巴豆酰基‑CoA还原酶(醇形成)。

【技术特征摘要】
2010.05.05 US 61/331,8121.非天然存在的微生物，其包括生产巴豆醇的生物合成途径，其中所述生物合成途径包括编码以足以生产巴豆醇的量表达的至少一种代谢途径酶的至少一种外源性核酸，其中所述代谢途径酶选自巴豆酰基-CoA还原酶(醛形成)、巴豆醛还原酶(醇形成)、巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或转移酶、巴豆酸酯还原酶和巴豆酰基-CoA还原酶(醇形成)。2.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物包括一种、两种或三种外源性核酸，每种均编码代谢途径酶。3.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸编码巴豆酰基-CoA还原酶(醛形成)和巴豆醛还原酶(醇形成)。4.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源性核酸编码巴豆酰基-CoA还原酶(醇形成)。5.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，所述至少一种外源性核酸编码巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或转移酶和巴豆酸酯还原酶。6.生产巴豆醇的方法，该方法包括在多种条件下培养根据权利要求1-5的任一项所述的非天然存在的微生物达足够长的时间，以生产巴豆醇。7.非天然存在的微生物，该微生物包括具有丁二烯途径的微生物，其包括编码以足以生产丁二烯的量表达的丁二烯途径酶的至少一种外源性核酸，所述丁二烯途径包括丁二烯合酶、乙酰基-CoA:乙酰基-CoA酰基转移酶、乙酰乙酰基-CoA还原酶、3-羟基丁酰基-CoA脱水酶、巴豆酰基-CoA还原酶(醛形成)、巴豆醛还原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、巴豆酰基-CoA水解酶、合成酶或转移酶、巴豆酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·J·伯克，A·P·博加德，孙军，罗宾·E·奥斯特豪特，普里蒂·法克雅，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：美国;US