生物合成1，3丁二烯的方法技术

本申请描述了通过在丁二烯合成底物中形成两个乙烯基来生产丁二烯的生物化学途径。本申请描述的这些途径依赖于用于最终酶促步骤的酶，比如甲羟戊酸二磷酸脱羧酶、异戊二烯合酶和脱水酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】生物合成1，3 丁二烯的方法 相关申请的交叉引用 本申请要求2012年11月30日提交的国际申请号PCT/US2012/067463(该申请要 求了 2011年12月2日提交的美国申请号61/566, 085和2012年10月17日提交的美国申 请号61/714, 883的优先权）的优先权；以及要求2012年6月15提交的国际申请号PCT/ 旧2012/042757(该申请要求了2012年10月17日提交的美国临时申请号61/714,883;2011 年12月2日提交的美国临时申请号61/566, 085和2011年6月17日提交的美国临时申请 号61/498, 408的优先权）的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。
本专利技术涉及生物合成1，3-丁二烯的方法，更具体地涉及使用一种或多种分离的 酶如脱氢酶、单加氧酶、去饱和酶、脱水酶和脱羧酶，或者使用表达一种或多种此类酶的重 组宿主细胞合成1，3-丁二烯。 背景 1，3_ 丁二烯（下文称丁二烯）是用于产生包括苯乙烯-丁二烯-橡胶（SBR)、聚丁 二烯（PB)、苯乙烯-丁二烯乳胶（SBL)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂（ABS)的合成橡胶、 腈橡胶和己二腈的重要单体，所述己二腈用于生产尼龙-66 (White,Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)。 丁二烯通常作为蒸汽裂解工艺的副产物而产生，其被蒸馏为粗丁二烯流并通 过萃取蒸馈纯化（White,Chemico-BiologicalInteractions, 2007, 166, 10-14)。已 专门采用其他方法制备丁二烯，通过n-丁烷和n-丁烯的脱氢反应（胡得利工艺）； 和n_ 丁稀的氧化脱氢反应（Ox〇-D或 0-X-D工艺）（White,Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)。 工业上，全球95 %的丁二烯生产是通过使用石化基原料如石脑油的蒸汽裂解 工艺进行的。考虑到较高的生产成本和较低的工艺收率，专门生产丁二烯是没有意义的 (White,Chemico-BiologicalInteractions, 2007, 166, 10-14)。鉴于对石化原料的依赖以 及对于专门生产丁二烯的高能耗催化步骤而言；生物技术通过生物催化提供了一种替代方 法。生物催化是使用生物催化剂如酶对有机化合物进行生物化学转化。 因此，在这一背景下，很明显需要生产中间体特别是丁二烯的适宜方 法，其中所述方法是基于生物催化剂的（Jang等，Biotechnology&Bioengineeri ng，2012, 109(10)，2437 - 2459)。 生物来源的原料和石化原料均是生物催化工艺可行的初始原料。 在中碳链长度的酶底物中生成两个乙烯基是通过生物催化工艺合成丁二烯的关 键考虑因素。 尚无任何已知的在原核生物或真核生物中合成丁二烯的酶途径。已提出的 由生物质-糖生产1，3-丁二烯的三个潜在的途径为：（1)由乙酰基-CoA通过巴豆 酰基-C〇A;(2)由赤藓糖-4-磷酸；和（3)通过丙二酰基-CoA和乙酰基-CoA的缩合 反应。然而，尚无使用这些策略的信息报道（Jang等，Biotechnology&Bioengineeri ng，2012, 109(10)，2437 - 2459)。 利用原核生物或真核生物合成的最为类似的化合物是2-甲基-1，3- 丁二烯（异 戊二烯），其具有短的5碳链长和两个乙烯基。异戊二烯可以通过产生前体二甲基乙烯 基-PP的两条路线，即甲轻戊酸（mevalonate)和非甲轻戊酸途径合成〇(1^115^11^，13;[08(3；[. Biotechnol.Biochem.，2002, 66(8)，1619-1627)0 甲羟戊酸途径引入了脱羧酶甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（下文称MDD)，其在 形成异戊二稀的前体中生成第一个乙烯基（Kuzuyama,Biosci.Biotechnol.Bioch em.，2002, 66(8)，1619-1627)〇 因此，可以将甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（EC4. 1. 1. 33)标记为在由非天然底物合成 丁二烯中的候选酶。 在对与天然底物甲羟戊酸二磷酸相关联的3-甲基的作用的阐述中，已证实如 图12(a)所示的3-羟基-5-二磷酸戊酸的周转（turn-over)数KcatS〇. 23±0. (^， 其与天然底物的名义8. 33 ±Us-1]相比显著降低（Dhe-Paganon等，Biochemist ry，1994, 33, 13355 - 13362)。此外，与底物的反应仅进行得远到3-羟基的磷酸化，即无 可检测的脱羧产物，这意味着与天然底物相比脱羧率降低了至少300倍。总而言之， 认为3-甲基在稳定碳阳离子过渡态中是不可或缺的（Dhe-Paganon等，Biochemist ry,1994, 33, 13355 - 13362)。 已证实来自酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)的MDD酶接受3_羟基_3_甲 基-丁酸（图12(b))，其包括稳定碳阳离子过渡态的3-甲基，其是将所述底物转化为 异丁烯的底物。然而，与天然底物活性6. 4相比，该比活性显著降低 为 4. 8 ? 1CT6 (Gogerty&Bobik，Applied&EnvironmentalMicrobiolo gy,2010, 76(24), 8004 - 8010) 〇 在催化裂隙周围的丝氨酸和精氨酸残基与天然底物甲羟戊酸二磷酸的磷酸基之 间关键的底物结合相互作用已被阐明。因此，在催化裂隙中正确的底物方向对酶活性是重 要的，这就合理地解释了当接受3-羟基-3-甲基-丁酸（图14 (b))作为底物时MDD具有 低活性（Barta等，Biochemistry, 2012, 51，5611-5621)〇 与天然底物结合的3-甲基和焦磷酸基对于支撑MDD活性作用的重要性反对在由 不含这些关键基团的非天然前体合成丁二烯中使用MDD。 异戊二烯合酶（下文称ISPS)在异戊二烯合成的最终前体二甲基乙烯基-PP中生 成第二个乙烯基。 因此，可以将异戊二烯合酶（EC4. 2. 3. 27)标记为由非天然底物合成丁二烯的候 选酶。 与MDD类似，与天然底物二甲基乙烯基-PP结合的3-甲基 在稳定碳阳离子中起重要作用，假定所述碳正离子是过渡态中间体 (Silver&Fal1，J.Biol.Chem.，1995, 270 (22)，13010 - 13016;Kuzma等，Current Microbiology, 1995, 30, 97 - 103)〇 3-甲基对于支撑ISPS活性作用的重要性反对在由不含3-甲基的非天然前体合成 丁二烯中使用ISPS。除了MDD和ISPS以外，微生物通常能够通过脱水酶、解氨酶（ammonialyase)、去 饱和酶或脱羧酶的活性在代谢物中生成乙烯基。然而，这些酶的活性很少能够催化末端乙 烯基的形成。脱水酶和解氨酶通常接受具有活化的氢原子的脂肪酸类似物或芳香族化合 物，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物合成丁二烯的方法，所述方法包括在丁二烯合成底物中形成两个末端乙烯基基团。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：PS珀尔曼，C陈，A博特斯，AVE康拉德，
申请(专利权)人：英威达技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH