本申请描述了通过在丁二烯合成底物中形成两个乙烯基而产生丁二烯的生物化学途径。本申请描述的这些途径依赖于用于最终酶促步骤的酶如甲羟戊酸二磷酸脱羧酶、异戊二烯合酶和脱水酶。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,3丁二烯的方法【专利摘要】本申请描述了通过在丁二烯合成底物中形成两个乙烯基而产生丁二烯的生物化学途径。本申请描述的这些途径依赖于用于最终酶促步骤的酶如甲羟戊酸二磷酸脱羧酶、异戊二烯合酶和脱水酶。【专利说明】,3 丁二烯的方法 相关申请的交叉引用 本申请要求2011年12月2日提交的美国申请61/566, 085和2012年10月17日 提交的美国申请61/714, 883的优先权，将其全部公开内容并入本文作为参考。
本专利技术涉及，3- 丁二烯的方法，并且更具体地，涉及使用一种或者多种 分离的酶如去氢酶、单氧化酶、去饱和酶、脱水酶，和脱羧酶，或者使用表达这些酶中的一种 或者多种的重组宿主细胞合成1，3- 丁二烯。
技术介绍
1，3-丁二烯（下文称为丁二烯）是用于生产合成橡胶（包括苯乙烯-丁二烯-橡 胶（SBR)、聚丁二烯（PB)、苯乙烯-丁二烯胶乳（SBL)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂 (ABS)、丁腈橡胶，和己二腈）的重要单体，其在制造Nylon-66 (White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)中使用。 丁二烯通常作为蒸汽裂化过程的副产品产生，蒸馏成粗制丁二烯流，并经萃取蒸 馈纯化（White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)。 除了其它方法之夕卜，有意的丁二烯也可通过以下方法制备：正丁烷和 正丁烯的脱氢（Houdry方法）；和正丁烯的氧化脱氢（Oxo-D或者O-X-D方法） (White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)〇 在工业上，全球9 5 %的丁二烯生产使用基于石化产品的给料如石脑油经 蒸汽裂化过程进行。有意的丁二烯的生产效果不好，制造成本高并且工艺收率低 (White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)〇 依赖于石化产品给料和对于有意的丁二烯而言的能源密集型催化步骤；生物技术 经生物催化提供了替代方法。生物催化是使用生物催化剂如酶实施有机化合物的生物化学 转换。 因此，针对这样的背景，很明显需要用于制造中间体（具体为丁二烯）的可持续的 方法，其中所述方法基于生物催化剂（Jang等人，Biotechnology and Bioengineering, 20 12, 109(10)，2437 - 2459)。 生物来源的给料和石化产品的给料均为用于生物催化过程的可行的起始原料。 在经生物催化过程合成丁二烯中，在中等碳链长度的酶底物中产生两个乙烯基是 一个关键的考虑因素。 在原核生物或者真核生物中没有已知的导致合成丁二烯的酶途径。已经提出了用 于由生物质-糖产生1，3-丁二烯的三种可能的途径：（1)经巴豆酰基-CoA从乙酰基-CoA ; (2)从赤藓糖-4-磷酸；和（3)经与丙二酸单酰基-CoA和乙酰基-CoA的缩合反应。然而， 使用这些策略的信息还未有报导（Jang等人，Biotechnology and Bioengineering, 2012， 109(10)，2437 - 2459)。 通过原核生物或者真核生物合成的最接近的类似化合物是2-甲基-1，3- 丁二 烯（异戊二烯），给出短的五碳链长和两个乙烯基。异戊二烯可经两种导致前体二甲基 乙烯基-PP的途径合成，即，甲轻戊酸和非甲轻戊酸途径0^^115^1]^，13;[08(3；[.13;[(^6(3111101. Biochem.，2002, 66(8)，1619-1627)。 甲羟戊酸途径包括一种脱羧酶，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（下文称为 MDD),其在异戊二烯的前体中产生第一乙烯基〇(1^11}^11^，13;[08(3；[.13;[(^6(3111101. Biochem.，2002, 66(8)，1619-1627)。 因此在从非天然底物合成丁二烯中可将甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（EC 4. I. 1. 33) 指定为候选酶。 在阐释与天然底物甲羟戊酸二磷酸相关的3-甲基的功能中，已经证实，图12(a) 中所示的3-羟基-5-二磷酸戊酸的转换数k eat为0. 23 ±0. 05 ，这与天然底物的标称 的 8. 33±l形成对比（Dhe-Paganon 等人，Biochemistry, 1994,33, 13355 - 13362)。另 夕卜，与底物的反应仅进展至3-羟基的磷酸化，S卩，未检测到脱羧产物，这暗示与天然底物相 t匕，脱羧率至少降低300倍。总之，在稳定碳正离子过渡态中3-甲基被认为是不可缺少的 (Dhe-Paganon 等人，Biochemistry, 1994, 33, 13355 - 13362)。 已经证实，来自酿酒酵母菌的MDD酶接受3-羟基-3-甲基-丁酸（图12(b))(其 包含稳定碳正离子过渡态的3-甲基）作为底物，从而将所述底物转化成异丁烯。然而，t匕 活性为 4. 8 ? 10_6，比 6. 4的天然底物活性低得多 (Gogerty 和 Bobik，Applied&Environmental Microbiology, 2010, 76(24)，8004 - 8010)。 已经阐明了在催化裂隙（catalytic cleft)的外围上的丝氨酸和精氨酸残基与天 然底物甲羟戊酸二磷酸的焦磷酸酯基的关键底物结合相互作用。因此，在催化裂隙内的正 确底物取向对于酶活性是重要的，这似乎解释了当接受3-羟基-3-甲基-丁酸（图14 (b)) 作为底物时 MDD 的低活性（Barta 等人，Biochemistry, 2012, 51，5611-5621)。 与天然底物相关的3-甲基和焦磷酸酯基在支持MDD活性中的重要性的教导反对 在从不含这些关键基团的非天然前体合成丁二烯中使用MDD。 酶异戊二烯合酶（下文称为ISPS)在异戊二烯合成的最终前体二甲基乙烯基-PP 中产生第二乙烯基。 因此，在从非天然底物合成丁二烯中可将异戊二烯合酶（EC 4. 2. 3. 27)指定为候 选酶。 类似于MDD，与天然底物二甲基乙烯基-PP相关的3-甲基在稳 定已经被假定为瞬时中间产物的碳正离子中发挥重要作用（Silver和 Fall, J. Biol. Chem.，1995, 270 (22)，13010 - 13016 ;Kuzma 等人，Current Microbiology, 1995, 30, 97-103)。 3-甲基在支持ISPS活性中的重要性的教导反对从不含3-甲基的非天然前体合成 丁二烯中使用ISPS。 除了 MDD和ISPS，微生物通常借助脱水酶、脱氨酶、去饱和酶或者脱羧酶活性可在 代谢物中产生乙烯基。然而，这些酶活性很少催化末端乙烯基的形成。脱水酶和脱氨酶通 常接受具有活化的氢原子的脂肪酸类似物，或者芳族化合物，其中芳环用作吸电子基团。去 饱和酶在脂肪酸合成中起着重要作用，在沿着长链脂肪酸的固定的非末端位置产生不本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于生物合成丁二烯的方法，所述方法包括在丁二烯合成底物中形成两个末端乙烯基。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：PS珀尔曼，C陈，A波特斯，AVE康拉蒂，
申请(专利权)人：英威达技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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