一种可用于蓝白筛选的多功能的TA克隆载体系统及其用途技术方案

本发明专利技术通过调整编码框架的方法，构建一种多功能的TA克隆载体系统。与常规商品化TA载体相比，本发明专利技术TA克隆时的假阳性和假阴性率降低；载体自连现象明显改善。本发明专利技术更具有创造性的用途是，可提供插入序列后菌落由蓝变白和由白变蓝两种选择，其中由白变蓝的选择能达到假阳性和假阴性均低于1％。其次，本载体可用于肿瘤相关基因移码突变的微小病变检测，这是目前市场具有这一功能的独家产品；且本载体能用于反因子蛋白酶TALENs有效性的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术。通过调整编码框架的方法，构建三种TA克隆载体。与常规商品化TA载体相比，除保留了由蓝变白的筛选之外，增加了由白变蓝的新选择，可用于微小突变的检测和反因子核酸酶活性的检测。
技术介绍
目前，分子生物学实验中大多数克隆载体都是经人工构建的，基本上都带有可供选择的遗传标志或表型特征。蓝白斑筛选(β-半乳糖苷酶系统)是较常用的筛选标记。此类载体携带lacZ’基因，它编码β-半乳糖苷酶的N-末端(α-肽)，并且处于诱导物IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解)诱导的启动子调控之下。质粒转化的宿主菌为LacZ△M15基因型(含有编码N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因)。未重组的质粒转化宿主菌后，在IPTG的诱导下，质粒与宿主菌分别表达缺陷但可以相互补偿的两个肽(即α-互补)，形成了有功能的β-半乳糖苷酶，该酶能把培养基中无色的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝，菌落呈现蓝色。但当外源DNA插入质粒位于α-肽编码序列中的多克隆位点时，由于破坏了α-肽的阅读框架，使其编码的α-肽失去活性，则重组子所在的细菌不能完成α互补，不能形成有活性的β-半乳糖苷酶，致使重组菌形成白色菌落。因此，可以借助蓝白斑筛选出重组子.尽管蓝白斑筛选应用了三十余年，但假阳性和假阴性率仍然很高。Slilaty SN和Lebel S.[1]研究证明，蓝白斑筛选的载体，通常将插入位点放在LacZ基因的起始密码子ATG到第7个氨基酸密码子之间。但如果将插入位置改变到LacZ基因的第11-36个氨基酸密码子之间，那么就可以完全消除假阳性和假阴性。Genomics One公司正是利用了他们的研究结果开发出TrueBlue技术，同样是蓝白斑筛选，但准确率可达100％。不过实际操作中仍出现一定程度的假阳性和假阴性。为了解决现有技术中存在的上述缺陷，本专利技术由此而来。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种高效率和多功能的TA克隆载体体系。该载体体系的优点是既能采用由蓝变白的选择方式，又能采用由白变蓝的选择方式，降低了假阳性和假阴性的发生，除能用于克隆PCR产物外，还能用于微小病变的检测，能用于反因子核酸酶活性的检测等。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为，一种可用于蓝白筛选的多功能的TA克隆载体系统，其由pMD19-JZ3，pMD19-JZ2,和pMD19-JZ1三种质粒组成；其中，pMD19-JZ3的基因序列为Seq No.3，pMD19-JZ2的基因序列为Seq No.2，其中碱基N选自A,T,C,G；pMD19-JZ1的基因序列为Seq No.1,其中碱基N选自A,T,C,G。本专利技术的优选技术方案中，质粒体pMD 19-JZ3为本身阅读框未发生移码的载体；质粒体pMD 19-JZ2为本身阅读框因增加了二对碱基发生移码的载体；质粒体pMD 19-JZ 1为本身阅读框因增加了一对碱基发生移码的载体。本专利技术的优选技术方案中，pMD19-JZ2的基因序列为Seq No.2，第433位碱基N为g,第434位碱基N为t；pMD19-JZ1的基因序列为Seq No.1,第433位碱基N为t。本专利技术的第二方面的所要解决的技术问题是提供一种多功能的TA克隆载体体系用于亚克隆，其中，TA克隆载体体系由pMD19-JZ3，pMD19-JZ2,和pMD19-JZ1三个质粒体组成；其中，pMD19-JZ3的基因序列为Seq No.3，pMD19-JZ2的基因序列为Seq No.2，pMD19-JZ1的基因序列为Seq No.1。本专利技术的第三方面的所要解决的技术问题是提供一种多功能的TA克隆载体体系用于用于微小病变的基因检测，其中，TA克隆载体体系由pMD19-JZ3，pMD19-JZ2,和pMD19-JZ1三个质粒体组成；其中，pMD19-JZ3的基因序列为Seq No.3，pMD19-JZ2的基因序列为Seq No.2，pMD19-JZ1的基因序列为Seq No.1。在大量实验的基础上，我们发现一个现象：应用TrueBlue技术的蓝白斑筛选载体，插入片段小于100bp时，若插入片段是3的整数倍则菌落呈蓝色；若是3的非整数倍则菌落呈白色。在分子生物学实验中，常需要将扩增的PCR产物进行克隆。Taq酶是最早发现的可用来进行PCR反应的DNA聚合酶,该酶的一个重要特点是在产物的3'末端以不依赖于模板的方式掺入A碱基,导致PCR产物不能以平末端的方式克隆,而需要用特殊的载体即T载体进行克隆。T载体作为一种克隆PCR产物的有效工具，因其3'末端带有突出的T碱基,可直接与PCR扩增产物3'末端突出的A碱基配对,因此大大提高了PCR产物与载体的连接效率。由于现有T载体仅仅采用由蓝变白这样一种选择，而实际结果是有些蓝色菌落含有插入序列，另一些白色菌落为空载体。本产品专利技术以常用的PMD19-T vector为基础改建，构建了含有3种载体的TA克隆载体体系——分别命名为pMD19-JZ3,pMD19-JZ2,和pMD19-JZ1,与常规的TA克隆载体相比，本专利技术TA克隆时的假阳性和假阴性率降低；载体自连现象明显改善。本专利技术的技术方案是：本产品由pMD19-JZ3,pMD19-JZ2,和pMD19-JZ1三个质粒体组成TA克隆载体系统；其中的质粒体pMD19-JZ3为本身阅读框未发生移码的载体；质粒体pMD19-JZ2为本身阅读框因增加了二对碱基发生移码的载体；质粒体pMD19-JZ1为本身阅读框因增加了一对碱基发生移码的载体。(序列见表1)上述三种载体的共同特征是均为双链线性DNA，且具有三末端一个胸腺嘧啶碱基突出(见表1)。这种含有三末端突出T的载体分子，用于亚克隆时，能与低保真DNA聚合酶的PCR产物中含有三末端突出腺嘌呤的片段形成互补的粘性接头，在DNA连接酶作用下，克隆效率高于平末端。由于本产品所含三个质粒体的共性，因此均能用于亚克隆(见应用例1,2,3)。通过使用Pfu作为对照，应用例1,2,3还同时表明，本产品体系对于高保真DNA聚合酶产生的平末端产物克隆效率极低。(图1,A tag B pfu)表1结合我们发现的蓝白斑筛选的新现象，本专利技术更具有创新性的用途是，可提供插入序列后菌落由蓝变白和由白变蓝两种选择，其中由白变蓝的选择能达到假阳性和假阴性均低于1％。其次，本载体可用于肿瘤相关基因移码突变的微小病变检测，这本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可用于蓝白筛选的多功能的TA克隆载体系统，其由pMD19‑JZ3，pMD19‑JZ2,和pMD19‑JZ1三种质粒组成；其中，pMD19‑JZ3的基因序列为Seq No.3，pMD19‑JZ2的基因序列为Seq No.2，pMD19‑JZ1的基因序列为Seq No.1。

【技术特征摘要】
1.一种可用于蓝白筛选的多功能的TA克隆载体系统，其由pMD19-JZ3，pMD19-JZ2,和
pMD19-JZ1三种质粒组成；其中，pMD19-JZ3的基因序列为Seq No.3，pMD19-JZ2的基因序列
为Seq No.2，pMD19-JZ1的基因序列为Seq No.1。
2.根据权利要求1所述的多功能的TA克隆载体体系，其特征在于，质粒体pMD19-JZ3
为本身阅读框未发生移码的载体；质粒体pMD19-JZ2为本身阅读框因增加了二
对碱基发生移码的载体；质粒体pMD19-JZ1为本身阅读框因增加了一对碱基发
生移码的载体。
3.根据权利要求1或2所述的多功能的TA克隆载体体系，其特征在于，pMD19-JZ2的
基因序列为Seq No.2，第433位碱基n为g,第434位碱基n为t；pMD19-...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凯，潘韵芝，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32