应用MLPA检测细胞遗传学异常的方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了应用MLPA检测细胞遗传学异常的方法及试剂盒，属于细胞遗传学异常检测技术领域，所述方法包括以下步骤：分别分离细胞检测样本和细胞参照样本中的单个核细胞从中分选获得CD138阳性浆细胞；提取所述CD138阳性浆细胞的基因组DNA；将所述基因组DNA变性后，进行MLPA反应、连接和PCR扩增获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行毛细管电泳，比较细胞检测样本和细胞参照样本的毛细管电泳结果分析细胞遗传学异常。本发明专利技术所述方法可以同时检测多达100个基因的外显子情况，包括小拷贝数的缺失或重复；并且所述试剂盒检测快速、简单、价格便宜、特异性高。特异性高。

【技术实现步骤摘要】
应用MLPA检测细胞遗传学异常的方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于细胞遗传学异常检测
，尤其涉及应用MLPA检测细胞遗传学异常的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]多发性骨髓瘤(MM)是一种具有遗传学异质性的浆细胞恶性肿瘤，发病率占恶性血液病的10％～15％，好发于中老年人。主要表现为骨痛、贫血、持续感染、高钙血症、肾功能异常等。MM生存期从数月到15年以上不等，虽然近年来出现了一些新药使患者预后显著改善，但仍然不可治愈。因此建立准确的预后判断体系对制定精准治疗方案有重要的临床意义。
[0003]近年研究发现几乎所有的MM患者均存在细胞遗传学异常，遗传学异常是影响MM预后最重要的因素。对于细胞遗传学异常的检测方法主要包括传统染色体检测法、荧光原位杂交法、比较基因组杂交法和全基因组测序法。
[0004]传统染色体检测法基于显带技术，是将处理后的染色体染色，每个染色体都有特定带纹，带纹的变化表示该染色体的改变。其可以检测染色体数目及结构异常，对判定疾病危险度有重要临床意义。传统染色体检测必须在细胞中期分裂条件下进行，只能检出1/3患者的细胞遗传学异常，且由于结果判定依赖于检验者的经验，主观性大，在应用中受到了很大限制。
[0005]荧光原位杂交(FISH)的基本原理是将寡聚核苷酸探针与变性后核酸按照碱基互补配对原则进行杂交，经处理后形成靶DNA与核酸探针的杂交体，在荧光显微镜下显影，即可对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。该技术不需要中期分裂象，检出率高，结果准确，检验快速，操作安全，成为传统染色体检测法的一个有益补充。但其局限性是不能检测完整的染色体变异，仅能辨识特异性探针结合区域。
[0006]比较基因组杂交(CGH)是在1992年后发展起来的分子细胞遗传学技术，其基本原理是用不同的荧光染料通过缺口平移法分别标记肿瘤组织和正常细胞或组织的DNA，制成探针，并与健康人的间期染色体进行共杂交，以在染色体上显示肿瘤与健康对照的荧光强度的不同来反映整个肿瘤基因组DNA表达情况的变化，再借助于图像分析技术可对染色体拷贝数量的变化进行定量研究。该法所需DNA样本量较少，适用于外周血、培养细胞、新鲜组织样本、存档组织研究及DNA量少而经聚合酶链反应(PCR)扩增样本的研究。但CGH技术所能检测到的最小的DNA扩增或丢失是在3～5Mb，故对于低水平的DNA扩增和小片段的丢失会漏检；且价格较昂贵，有一定技术难度，目前主要应用于临床试验或科研，尚未普遍应用于临床。
[0007]全基因组测序即对一种生物的基因组的全部基因进行测序，测定其DNA的碱基序列。该方法是在1986年首次被Renato Dulbecco提出，他认为如果能够知道所有人类基因序列，对癌症研究将有很大帮助。但该方法耗时、耗力、耗财，目前尚未用于临床。
[0008]随着检测技术的不断进步，遗传学异常的检出率逐渐提高。虽然目前FISH是细胞
遗传学异常检测的标准方法，但仍有缺陷，并不能获得完整的染色体异常信息，检出率未达到遗传学异常的发生率，并且研究者水平参差不一，使得各个遗传学异常的预后意义仍存在差异。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供应用MLPA检测细胞遗传学异常的方法及试剂盒；本专利技术所述方法可以同时检测多达100个基因的外显子情况，包括小拷贝数的缺失或重复。并且所述试剂盒检测快速、简单、价格便宜、特异性高，对细胞遗传学检测有临床推广潜力。
[0010]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0011]本专利技术提供了一种应用MLPA检测细胞遗传学异常的方法，包括以下步骤：
[0012]1)分别分离细胞检测样本和细胞参照样本中的单个核细胞，制备为细胞悬液；
[0013]2)将所述细胞悬液与CD138磁珠混合分选获得CD138阳性浆细胞；
[0014]3)提取所述CD138阳性浆细胞的基因组DNA；
[0015]4)将所述基因组DNA变性后，与MLPABuffer和MPLAprobe mix混合进行MLPA反应获得MLPA产物；
[0016]5)将所述MLPA产物与连接酶混合液混合进行连接获得连接产物；
[0017]6)将所述连接产物和PCR聚合酶混合液混合进行PCR扩增获得PCR扩增产物；
[0018]7)对所述PCR扩增产物进行毛细管电泳，比较细胞检测样本和细胞参照样本的毛细管电泳结果分析细胞遗传学异常；当所述细胞检测样本的毛细管电泳结果在所述细胞参照样本的毛细管电泳结果范围内，认为细胞遗传学正常，否则认为细胞遗传学异常。
[0019]优选的，步骤3)中所述的基因组DNA的A260/A280为1.6～1.9；所述基因组DNA的浓度为20～30ng/μl。
[0020]优选的，步骤4)中所述变性的程序为98℃，5min变性；25℃，10min；所述变性后的基因组DNA、MLPABuffer和MPLAprobe mix的体积比为5：1.5：1.5。
[0021]优选的，所述MLPA反应的程序为95℃，1min；60℃，16～20h。
[0022]优选的，所述MPLAprobe mix包括核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.53所示的探针。
[0023]优选的，所述MLPA产物与连接酶混合液的体积比为1：4；所述连接的程序为54℃，15min；98℃，5min；20℃保持。
[0024]优选的，步骤6)所述的连接产物和PCR聚合酶混合液的体积比为4：1；所述PCR扩增的程序如下：95℃、30s；60℃、30s，72℃、60s，35个循环；72℃、20min；15℃停止。
[0025]优选的，所述细胞检测样本和细胞参照样本的数量比为(7～15)：1。
[0026]本专利技术提供了应用MLPA检测细胞遗传学异常的试剂盒，包括所述的MPLAprobe mix。
[0027]优选的，包括所述的PCR聚合酶混合液；所述PCR聚合酶混合液包括PCR扩增引物。
[0028]本专利技术的有益效果：本专利技术提供的应用MLPA检测细胞遗传学异常的方法，将MLPA应用于检测细胞遗传学异常，具有高通量、样本需求量少、耗时短、操作简单、重复性和灵敏度高的优势；能够更加快速、精确地检测细胞遗传学异常。
附图说明
[0029]图1为伴1q21扩增的MM患者MLPA结果；
[0030]图2为同时伴1q21扩增、13q缺失、17p缺失、16q缺失复杂细胞遗传学异常的MM患者MLPA结果；
[0031]图3为MLPA检测MM细胞遗传学异常数；
[0032]图4为MLPA检测不同遗传学异常的预后意义；
[0033]图5为MLPA检测细胞遗传学异常的流程。
具体实施方式
[0034]本专利技术提供了一种应用MLPA检测细胞遗传学异常的方法，包括以下步骤：1)分别分离细胞检测样本和细胞参照样本中的单个核细胞，制备本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种应用MLPA检测细胞遗传学异常的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分别分离细胞检测样本和细胞参照样本中的单个核细胞，制备为细胞悬液；2)将所述细胞悬液与CD138磁珠混合分选获得CD138阳性浆细胞；3)提取所述CD138阳性浆细胞的基因组DNA；4)将所述基因组DNA变性后，与MLPABuffer和MPLAprobe mix混合进行MLPA反应获得MLPA产物；5)将所述MLPA产物与连接酶混合液混合进行连接获得连接产物；6)将所述连接产物和PCR聚合酶混合液混合进行PCR扩增获得PCR扩增产物；7)对所述PCR扩增产物进行毛细管电泳，比较细胞检测样本和细胞参照样本的毛细管电泳结果分析细胞遗传学异常；当所述细胞检测样本的毛细管电泳结果在所述细胞参照样本的毛细管电泳结果范围内，认为该细胞遗传学正常，否则认为该细胞遗传学异常。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的基因组DNA的A260/A280为1.6～1.9；所述基因组DNA的浓度为20～30ng/μl。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述变性的程序为98℃，5min变性；25℃，10min；所述变性后的基因组DNA、MLPABuf...

【专利技术属性】
技术研发人员：安刚，邱录贵，阎禹廷，于珍，秦小琪，藏美蓉，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：