本发明专利技术涉及PCR步移技术领域，具体涉及一种用于基因组步移的差异退火介导的茎环PCR技术。本发明专利技术利用长度与退火温度适中的引物介导茎环形成，构成特异性扩增目标分子的结构基础,这些茎环形成引物还具有如下特点：或与已知序列一致，或额外在其3
【技术实现步骤摘要】
一种用于基因组步移的差异退火介导的茎环PCR技术
[0001]本专利技术涉及PCR步移
，具体涉及一种用于基因组步移的差异退火介导的茎环PCR技术。
技术介绍
[0002]基于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)的步移技术已取代基于基因组文库的步移方法，被广泛应用于获取已知DNA区域的未知侧翼序列。当前已报道的PCR基染色体步移技术达数十种。但根据原理不同可以将这些方法分为三类：(1)反向PCR；(2)连接介导PCR；(3)随机引发PCR。
[0003]反向PCR首先利用限制性内切酶对DNA模板进行切割，然后利用连接酶将切割的片段连接成环，其中同时包含了已知和未知区域；然后采用一对依据已知区域设计的、扩增方向相反的特异性引物进行扩增，实现未知侧翼分子的富集。连接介导PCR采用限制性内切酶对DNA进行处理，然后在其两端连接人工合成的双链DNA接头，利用接头引物和特异性引物进行2-3轮巢式PCR，达到扩增目的片段的目的。反向PCR和连接介导PCR均需要酶切和连接处理，对模板质量要求较高，同时增加了实验复杂性和成本，减低了效率。
[0004]随机引发PCR则通过随机引物(即步移引物)在未知区段发生延伸方向指向已知序列的随机退火，该随机引物即可与特异性引物配对，对目标分子进行扩增；然后在接下来的PCR中，通过(1)不对称退火、(2)随机引物部分退火或(3)茎环PCR等原理富集目标产物。随机引发PCR是一种不依赖任何前处理的方法，操作简单。其中基于茎环的技术在第二轮及以后的PCR中使用特异性引物，因而能降低非特异性扩增。然而，现有的茎环PCR需使用很长的随机简并引物介导茎环形成，在有限的已知区域内只能设计一条随机引物，引物设计的可选择性较低；同时介导茎环形成的引物仅发生一次退火，因而失败的概率较高。
技术实现思路
[0005]本专利技术提供了一种新的茎环PCR策略，可以同时利用多条较短的特异性引物(还能在其3
’
端引入自由碱基)介导茎环形成，其原理与操作过程如图1所示。首先，利用高退火温度的特异性引物(Specific primer,SP)和退火温度适中的茎环形成引物(Stem-loop forming primer，SLFP)进行第一轮PCR，用于介导茎环形成；随后使用一对特异性引物：茎引物(Stem primer,StP)和环引物(Loop primer,LoP)对目标分子进行指数富集。非特异性分子因为没有茎特异性引物或者环特异性引物的结合位点而被消除。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供一种用于基因组步移的步移引物设计策略，所述基因组步移反应的引物别为SP、SLFP、StP、LoP，引物根据已知序列进行设计，设计的引物对基因的未知侧翼进行获取，引物SP和引物SLFP用于第一轮PCR，用于介导茎环形成，引物StP和引物LoP用于第二轮PCR，对目标分子进行指数富集。
[0007]优选的，所述引物SLFP长度为15-20bp，退火温度45—55℃，特异性引物长度为20-25bp，退火温度60—65℃，引物SP、SLFP、StP与LoP的延伸方向一致，且按照依次排列在已知
区域。
[0008]优选的，所述SLFP长度及退火温度适中且明显低于配对使用的SP，SLFP或与已知序列一致或额外在其3
’
端引入1-3个自由碱基，SLFP在有限的已知区域内设计多条进行平行试验。
[0009]优选的，所述引物SP的序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，引物SLFP的序列如序列表中SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:15所示，引物StP的序列如序列表中SEQ ID NO:16～SEQ ID NO:18所示，引物LoP的序列如序列表中SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:21所示。
[0010]优选的，所述差异退火介导的茎环PCR方法包括以下步骤：
[0011]第一轮PCR反应:
①
94℃变性2min；
②
5个高严谨(60℃)循环，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min；
③
一个低严谨循环：94℃变性30s，25℃退火30s，72℃延伸2min；
④
15个适中温度退火循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min；
⑤
25个高严谨循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min；
⑥
72℃延伸10min。
[0012]第二轮PCR反应:
①
94℃变性2min，
②
35个高严谨循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min；
③
72℃延伸10min。
[0013]优选的，所述第一轮PCR反应体系为：0.4mM dNTP Mixture，1
×
Mg
2+
Plus LA PCR bufferⅡ，基因组DNA，其中细菌10-100ng，水稻100-1000ng，0.2μM SP，任意一条0.2μM SLFP，2.5U TaKaRa LA Taq，无菌双蒸水补足体积至50μL。
[0014]优选的，所述第二轮PCR反应体系为：0.4mM dNTP Mixture，1
×
Mg
2+
Plus LA PCR bufferⅡ，1μL第一轮PCR产物，0.2μM StP，0.2μM LoP，2.5U TaKaRa LA Taq，无菌双蒸水补足体积至50μL。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术涉及的SLFP引物较短，能有限的已知区设计多条SLFP；同时可在SLFP的3
’
末端可以任意添加错配碱基，进一步增加了茎环形成引物设计的可选择性与灵活性。因此，借助于有限的已知区可以进行多次平行茎环反应。本策略一方面增加了步移的成功率；另外，不同的SLFP可以在未知区域的不同位点退火，通过平行PCR，可以获得不同长度的产物，即通过一次平行反应，可能获得大片段DNA，提高了步移效率。在第一轮PCR中生成的所有非特异性产物，因不存在任何引物的退火位点，在第二轮PCR中不能得到扩增。
附图说明
[0016]图1为差异退火介导茎环PCR原理图；
[0017]图2为短乳杆菌CD0817源基因组谷氨酸脱羧酶基因位点和水稻潮霉素基因侧翼序列上游引物步移结果；
[0018]图3为水稻潮霉素基因侧翼序列下游引物步移结果。
具体实施方式
[0019]下面结合实例对本专利技术进行进一步的说明。
[0020]实施例1
[0021]引物设计
[0022]SLFP引物或与已知序列一致或在3
’
末端存在1-3个错配碱基(表1)，引物长度在15-20bp，退火温度45—55℃。SP引物根据短乳杆本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于基因组步移的步移引物，其特征在于：所述基因组步移反应的引物别为SP、SLFP、StP、LoP，引物根据已知序列进行设计，设计的引物对基因的未知侧翼进行获取，引物SP和引物SLFP用于第一轮PCR，用于介导茎环形成，引物StP和引物LoP用于第二轮PCR，对目标分子进行指数富集。2.根据权利要求1所述引物，其特征在于：所述引物SLFP长度为15-20bp，退火温度45—55℃，特异性引物长度为20-25bp，退火温度60—65℃，引物SP、SLFP、StP与LoP的延伸方向一致，且按照依次排列在已知区域。3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于：所述SLFP长度及退火温度适中且明显低于配对使用的SP，SLFP或与已知序列一致或额外在其3
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端引入1-3个自由碱基，SLFP在有限的已知区域内设计多条进行平行试验。4.根据权利要求3所述引物，其特征在于：所述引物SP的序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，引物SLFP的序列如序列表中SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:15所示，引物StP的序列如序列表中SEQ ID NO:16～SEQ ID NO:18所示，引物LoP的序列如序列表中SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:21所示。5.一种如权利要求1所述的用于基因组步移的步移引物的差异退火介导的茎环PCR方法，其特征在于：所述差异退火介导的茎环PCR方法包括以下步骤：第一轮PCR反应:
①
94℃变性2min；
②
5个高严谨，60℃循环，94℃变性30s，60...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙天翼，李海星，贾梦雅，王凌琴，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：
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