实时荧光绝对定量检测家禽干扰素刺激因子的试剂盒、检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种实时荧光绝对定量检测家禽干扰素刺激因子的试剂盒、检测方法及应用。本发明专利技术实时荧光绝对定量检测家禽干扰素刺激因子的试剂盒，包含：上游引物、下游引物以及Taq Man探针。本发明专利技术提供利用上述的试剂盒检测家禽干扰素刺激因子的方法，包括：将标准品模板和待测样品DNA模板分别置于各自的反应体系中，并同时置入PCR仪进行扩增，扩增完毕后由PCR仪自动得出检测结果；检测结束后，根据噪音情况设定和调整基线及阈值并利用随机软件进行分析，建立标准曲线，根据荧光曲线和Ct值判断结果。本发明专利技术检测方法及试剂盒具有高灵敏度及相对的高特异性，而且可以精确定量检测标本中家禽干扰素刺激因子的mRNA表达量。中家禽干扰素刺激因子的mRNA表达量。中家禽干扰素刺激因子的mRNA表达量。

【技术实现步骤摘要】
实时荧光绝对定量检测家禽干扰素刺激因子的试剂盒、检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种实时荧光绝对定量检测家禽干扰素刺激因子的试剂盒、检测方法及应用，属于生物分析检测


技术介绍

[0002]干扰素刺激因子(STING)是与固有免疫应答密切相关的一种信号转导分子，在多种内皮细胞、上皮细胞和造血干细胞中均有表达，主要定位于胞内内质网、线粒体及微粒体的外膜上。人源STING(hSTING)蛋白由379个氨基酸组成，可分为3个结构功能域，包括N端的4次跨膜结构域(TM1～4)、二聚化结构域和C端面向胞质内的结构域。一般认为STING蛋白N端的4个TM使其能够锚定于内质网上，二聚化结构域高度保守，可能与其活化功能有关，而球状的C端结构域含有多种信号基序，其C尾端结构域对STING有着自我抑制作用，是招募TBK1的关键基序。
[0003]STING蛋白是DNA感受通路中的关键蛋白，，对于固有免疫和适应性免疫启动具有重要作用。STING作为信号转导接头蛋白能募集TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1，TBK1)并激活干扰素调节因子3(interferon regulat ory factor 3，IRF-3)，进而诱导Ⅰ型干扰素(IFN-α、IFN-β)的产生并调控抗肿瘤固有免疫应答反应。作为一种治疗方法，肿瘤内注射STING激动剂已经在多种小鼠肿瘤模型中显示出显著的治疗效果。干扰素刺激因子(STING)作为参与固有免疫应答的关键信号转导分子，在防御病毒及胞内细菌感染、介导Ⅰ型干扰素产生和调节体内自发性抗肿瘤免疫反应产生过程中发挥重要功能。然而在家禽肿瘤性疾病中STING的生物学功能还未见报道。
[0004]目前对于家禽STING的研究还处于起始阶段，各种检测家禽STING表达的方法还很欠缺。传统检测家禽干扰素刺激因子表达的方法灵敏度及特异性较差，而且不能够精确定量。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种实时荧光绝对定量检测家禽干扰素刺激因子的试剂盒、检测方法及应用，具有高灵敏度及相对的高特异性，而且可以精确定量检测标本中家禽干扰素刺激因子的mRNA表达量。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种实时荧光绝对定量检测家禽干扰素刺激因子的试剂盒，包含：
[0007]上游引物STING F:5
’-
GGTCCTACTACATCGGCTACCTGA-3
’
(SEQ ID N0.1)，
[0008]下游引物STING R:5
’-
GGCCTGAGCTTGTTGTCCTTATCT-3
’
(SEQ ID N0.2)，
[0009]以及Taq Man探针STING P:5
’-
FAM-TGGAAGCTCCACATCCTGGTC-TAMRA-3
’
(SEQ ID N0.3)。
[0010]优选地，所述的试剂盒还包含102、103、104、105、106、107、108拷贝/uL的家禽STING
基因阳性质粒作为标准品模板。
[0011]优选地，所述的家禽STING阳性质粒是以PCGGS载体为载体，在其EcoRI以及xho1HA位点插入序列如SEQ ID N0.3所示的部分家禽STING基因所得。
[0012]优选地，所述的试剂盒还包含通用型Taq Man基因扩增预混试剂盒。
[0013]本专利技术提供利用上述的试剂盒检测家禽干扰素刺激因子的方法，包括：
[0014]将标准品模板和待测样品DNA模板分别置于各自的反应体系中，并同时置入PCR仪进行扩增，扩增完毕后由PCR仪自动得出检测结果；检测结束后，根据噪音情况设定和调整基线及阈值并利用随机软件进行分析，建立标准曲线，根据荧光曲线和Ct值判断结果。
[0015]优选地，进入PCR仪的标准品模板和待测样品DNA模板的反应体系均为25u1：ABI Taq Man Universal PCR Master Mix加入量为12.5u1，模板加入量为3u1，上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5u mol/L，探针在体系中的终浓度为0.5u mol/L，其余为无菌去离子水。
[0016]优选地，所述PCR仪中的反应程序为：95℃预变性l0min，然后95℃15s，60℃1min 43个循环；荧光信号的收集及数据的采集温度为60℃。
[0017]本专利技术还提供一种上述的试剂盒在检测家禽干扰素刺激因子中的应用。
[0018]本专利技术所达到的有益效果：
[0019]本专利技术检测方法及试剂盒具有高灵敏度及相对的高特异性，而且可以精确定量检测标本中家禽干扰素刺激因子的mRNA表达量。因此运用实时荧光绝对定量技术对家禽STING进行实时的定量检测，为深入研究家禽STING具有重要作用。
附图说明
[0020]图1为实时荧光定量RT-PCR标准品扩增动力学曲线；
[0021]图2为实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
具体实施方式
[0022]下面结合附图对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。
[0023]实施例1荧光定量RT-PCR法检测家禽STING的表达
[0024]一、材料:
[0025]DNaseⅠ购自Fermentas公司。反转录试剂盒等购自大连TaKaRa公司。T载体连接酶购自Promega公司。dNTP购自上海生工生物工程有限公司。总RN A提取试剂盒为杭州Axygen产品。Taq Man Universal PCR Master Mix为美国ABI公司产品。其它为国产分析纯试剂。
[0026]二、引物及探针设计与合成:
[0027]以家禽STING全长cDNA序列(GenBank登录号KP893157)为模板，使用Prime r Express
TM
(V3.0，美国ABI公司)软件分析和设计引物，并根据同时考虑家禽S TING基因组DNA序列情况，从中选择最佳引物及探针序列。
[0028]检测用PCR上游引物STING F：5
’-
GGTCCTACTACATCGGCTACCTGA-3
’
(SEQ ID N0.1)，下游引物STING R：5
’-
GGCCTGAGCTTGTTGTCCTTA TCT-3
’
(SEQ ID N0.2)，以及Taq Man探针STING P：5
’-
FAM-TGGAAGCT CCACATCCTGGTC-TAMRA-3
’
(SEQ ID N0.3)，均由美国ABI公司合
成。
[0029]三、检测标准品制备：
[0030]按照Axygen公司总RNA小量制备试剂盒步骤提取DF本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.实时荧光绝对定量检测家禽干扰素刺激因子的试剂盒，其特征在于，包含：上游引物STING F:5
’-
GGTCCTACTACATCGGCTACCTGA-3
’
，下游引物STING R:5
’-
GGCCTGAGCTTGTTGTCCTTATCT-3
’
，以及Taq Man探针STING P:5
’-
FAM-TGGAAGCTCCACATCCTGGTC-TAMRA-3
’
。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含102、103、104、105、106、107、108拷贝/uL的家禽STING基因阳性质粒作为标准品模板。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的家禽STING阳性质粒是以PCGGS载体为载体，在其EcoR I以及xho1HA位点插入序列如SEQ ID N0.3所示的部分家禽STING基因所得。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含通用型Taq Man基因扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱琨，何惠芬，秦爱建，邵红霞，金文杰，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：