检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术及其应用制造技术

本发明专利技术公开了检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，在PCR仪的多个荧光通道中存在：1)至少有一个荧光通道检测两种以上的待测靶点；2)至少有一个靶点被两个以上的荧光通道所检测；3)至少有一个荧光通道检测26％以上的待测靶点；以及4)至少有一个荧光通道所检测的靶点数与其他荧光通道所检测的靶点数不相同。本发明专利技术通过采用单一荧光通道检测不同基因序列片段和不同通道检测不同基因片段的不同比例关系，在需要使用内参时，避免了必须内参使用非靶点序列和内参需要单独占用一个荧光通道的缺点，并可增加不同比例不同序列内参以提高检测特异性和防污染能力。高检测特异性和防污染能力。高检测特异性和防污染能力。

【技术实现步骤摘要】
检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种核酸分析技术，特别涉及检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术及其应用。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应PCR已广泛应用于基础研究和临床实践。多种PCR技术，尤其是实时荧光PCR技术，在临床上基因定性与定量分析中更是扩展了基因检测的范围。目前临床常用的荧光PCR仪，主要为提供4种或5种荧光通道，一般检测可以利用一个荧光通道作为内参，其余3种或4种荧光通道用于检测待测标本；或者，可以利用外在标准曲线的定性和定量方法。现有的核酸检测分析技术存在如下缺陷：
[0003]1)检测靶点数量有限，在4通道仪器中，现有技术中最高检测3～4个靶点；
[0004]2)检测敏感性不高；
[0005]3)出现假阳性检测结果；
[0006]4)不耐突变。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本专利技术在于提供检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术及其应用，其能够提高实时PCR用于定性鉴定特定基因序列的敏感性和特异性的目的。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，在PCR仪的多个荧光通道中存在：
[0009]1)至少有一个荧光通道检测两种以上的待测靶点；
[0010]2)至少有一个待测靶点被两个以上的荧光通道所检测；
[0011]3)至少有一个荧光通道检测26％以上的待测靶点；以及
[0012]4)至少有一个荧光通道所检测的靶点数与其他荧光通道所检测的靶点数不相同。
[0013]作为优选，所述检测26％以上的待测靶点的荧光通道采用特异荧光标记的荧光探针。
[0014]作为优选，所述检测26％以上的待测靶点的荧光通道采用非特异荧光染料。
[0015]作为优选，所述非特异荧光染料是Sybr Green。
[0016]作为优选，在检测RNA标本时，采用实时荧光rt-PCR。
[0017]作为优选，在检测DNA标本时，采用实时荧光PCR。
[0018]作为优选，存在两种以上的待测靶点的荧光通道中加入至少两个与所述待测靶点相对应的探针。
[0019]作为优选，在存在两种以上的待测靶点的荧光通道中，该荧光通道中有N个待测靶点以及与所述待测靶点相对应的N个探针，其中，探针混合液中的每个探针的浓度为探针工作液的1/N。
[0020]作为优选，所述荧光探针为TaqMan探针或者分子信标探针。
[0021]如上述所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术在核酸定性与定量分析中的应用。
[0022]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
[0023]1、本专利技术通过采用单一荧光通道检测不同基因序列片段和不同通道检测不同基因片段的不同比例关系，在需要使用内参时，避免了必须内参仅仅使用非靶点序列和内参需要单独占用一个荧光通道的缺点，并增加不同比例不同序列内参以提高检测特异性和防污染能力；
[0024]2、本专利技术采用全新的技术方案，在需要使用内参时可以引入待测基因作为内参，消除了内参占用荧光通道的传统做法，增加内参种类提高检测特异性和可靠性，同时内参还具有参与待测标本定性和定量分析的指标价值；
[0025]3、本专利技术将现有单一荧光PCR反应中探针的使用个数和待测靶点的个数，从传统的受到荧光通道个数的限制扩展到多于荧光通道的个数，提高了实时PCR平台基因检测的覆盖范围；
[0026]4、与现有的实时PCR定量分析时利用外在定量曲线参比的方式不同，本专利技术通过提高靶点检测容量为内置不同种类不同比例的待测基因片段作为定性和定量对照提供了可能，一方面可以提高检测结果的可靠性，同时不同标本与空白对照的比例关系，还为排除污染等假阳性提供信息。
附图说明
[0027]图1为空白与不同拷贝标本荧光PCR扩增曲线图一；
[0028]图2为空白与不同拷贝标本荧光PCR扩增曲线图二；
[0029]图3为空白与不同拷贝标本荧光PCR扩增曲线图三；
[0030]图4为空白与不同拷贝标本荧光PCR扩增曲线图四；
[0031]图5为空白与不同拷贝标本荧光PCR扩增曲线图五；
[0032]图6为空白与不同拷贝标本荧光PCR扩增曲线图六；
[0033]图7为实施例1的模板8818的扩增曲线图；
[0034]图8为实施例1的模板17616的扩增曲线图；
[0035]图9为实施例1的混合模板的扩增曲线图；
[0036]图10为实施例2的扩增曲线图；
[0037]图11为实施例3的扩增曲线图；
[0038]图12为实施例4的扩增曲线图；
[0039]图13为75个循环扩增之前的36个混合模板各特异性分子探针的Real-Time PCR扩增曲线图；
[0040]图14为75个循环扩增之后的36个混合模板各特异性分子探针的Real-Time PCR扩增曲线图；
[0041]图15为稀释前后，扩增曲线完全一致的两个模板A6,B12；
[0042]图16为稀释前后，扩增曲线迁移的模板B6；
[0043]图17为稀释扩增前后，扩增曲线往后移的模板C5；
[0044]图18为36个混合模板的Srbr Green荧光通道与C5荧光通道的单独的特异性分子探针扩增曲线图。
具体实施方式
[0045]参照附图对本专利技术做进一步说明。
[0046]本实施例公开了检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，在PCR仪的多个荧光通道中存在：1)至少有一个荧光通道检测两种以上的待测靶点；2)至少有一个待测靶点被两个以上的荧光通道所检测；3)至少有一个荧光通道检测26％以上的待测靶点，且该荧光通道采用特异荧光标记的荧光探针或者非特异荧光染料；其中，荧光探针为TaqMan探针或者分子信标探针，非特异荧光染料是Sybr Green；以及4)至少有一个荧光通道所检测的靶点数与其他荧光通道所检测的靶点数不相同。另外，上述技术方案，该实时PCR技术适用于4荧光通道、5荧光通道以及6荧光通道的PCR仪；另外，在检测RNA标本时，其采用实时荧光rt-PCR；在检测DNA标本时，其采用实时荧光PCR。
[0047]Sybr Green染料在核酸定性和定量分析中得到广泛应用。当Sybr Green用于定量PCR分析时，现有技术通常可与融解曲线结合，用于提高定性分析的能力。然而，目前的实时PCR仪没有Sybr Green与TaqMan探针或分子信标探针联合使用的选择。作为实际应用，优选地，在联合其他探针时，Sybr Green的荧光信号可以利用6-FAM通道获取。在选定特定荧光通道的PCR完成之后，PCR产物可以重新在Sybr Green选项下进行溶解曲线分析。
[0048]TaqMan实时荧光PCR技术，在核酸的定性与定量分析中具有很大优势本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：在PCR仪的多个荧光通道中存在：1)至少有一个荧光通道检测两种以上的待测靶点；2)至少有一个待测靶点被两个以上的荧光通道所检测；3)至少有一个荧光通道检测26％以上的待测靶点；以及4)至少有一个荧光通道所检测的靶点数与其他荧光通道不相同。2.根据权利要求1所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：所述检测26％以上的待测靶点的荧光通道采用特异荧光标记的荧光探针。3.根据权利要求1所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：所述检测26％以上的待测靶点的荧光通道采用非特异荧光染料。4.根据权利要求3所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：所述非特异荧光染料是Sybr Green。5.根据权利要求1所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，其特征是：在检测RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凯，廖端芳，张佳，
申请(专利权)人：李凯，
类型：发明
国别省市：