一种基于反向PCR技术检测CRISPR-Cas9位点特异性的方法技术

本发明专利技术提供一种基于反向PCR技术检测CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种基于反向PCR技术检测CRISPR
‑
Cas9位点特异性的方法


[0001]本专利技术涉及基因
，尤其涉及一种基于反向PCR技术检 测CRISPR
‑
Cas9位点特异性的方法。

技术介绍

[0002]簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统已被广泛应用 于生物学、医学等领域的研究中，但其有效性受到Cas9
‑
sgRNA的脱 靶效应和位点亲和力的影响，特别是在全基因组水平上。
[0003]早在2002年，人们证实了CRISPR广泛存在于细菌和古菌的基 因组中。后来，人们对CRISPR/Cas的研究不断深入，不仅仅是一种 原核生物的免疫防御机制，它极大地改变了我们对于各种生物的基因 编辑方式，特别是在真核生物和人类疾病的动物模型中。近年来，随 着CRISPR/Cas的不断发展，其在基础生物学、生物技术和医学中都 得到了广泛的应用。
[0004]CRISPR/Cas系统在医学等领域的有效应用受到了脱靶效应的影 响，特别是在全基因组范围内。当CRISPR/Cas系统修饰目标DNA 的同时，会引发不可预测的脱靶效应，造成基因组损伤，除或减少 脱靶效应的发生，研究者们为优化CRISPR/Cas系统的特异性进行了 广泛的探索。Valen等人建立了一个用于CRISPR基因组工程的网络 工具(CHOPCHOP)，通过识别单导RNA(sgRNA)靶点来避免脱靶效 应。尽管目前已经存在包含了丰富的数据库的sgRNA选择工具，但 一方面数据库对于各种生物的所有基因组位点来说仍是凤毛麟角，另 一方面CRISPR/Cas系统在不同基因组位点的切割效率具有一定差 异，目前的sgRNA选择工具还不能估计其差异，目前存在一些检测 方法，但是难以进行推广。
[0005]因此，有必要提供一种基于反向PCR技术检测CRISPR
‑
Cas9位 点特异性的方法解决上述技术问题。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术提供了一种基于反向PCR技术检测 CRISPR
‑
Cas9位点特异性的方法。
[0007]本专利技术提供的基于反向PCR技术检测CRISPR
‑
Cas9位点特异性 的方法包括以下步骤：
[0008]S1：sgRNA制备，首先将两条互补链退火并延伸，生成通用 sgRNA框架模板，然后通过融合PCR，将20bp与目标DNA互补的 特异性序列加入到通用sgRNA框架模板中，其次，通过融合PCR， 将T7启动子序列加入上一步的扩增产物中，最后，通过体外转录合 成sgRNAs；
[0009]S2：底物DNA制备，将血管内皮生长因子A的CDS合成并整 合到pUC57质粒中，用与pUC57质粒序列互补的通用引物UP1和 UP2扩增所有底物DNA，在20μLPCR反应体系下重组质粒DNA， 然后通过PCR反应，获得PCR产物，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电 泳纯化，纯化后的DNA片段用NanoDrop分光光度计定量，制得所 述底物DNA；
[0010]S3：反向PCR，将S1所述的sgRNA进行预孵化，获得预孵化 产物Cas9
‑
sgRNA复合物，将S2所述的底物DNA与预孵化产物混合， 在37℃下进行切割5min，然后将切割产物与T4连接酶连接，最后 进行定量PCR反应；
[0011]S4：对Cas9
‑
sgRNA位点特异性进行检测。
[0012]优选的，所述S1中，转录反应是将纯化后的产物与RNA转录 试剂在37℃下孵育过夜。
[0013]优选的，所述转录试剂为T7 RNA聚合酶、缓冲液和rNTPs。
[0014]优选的，所述S1还包括以下步骤：将转录产物与Trizol溶液混 合，然后先后用氯仿和异丙醇提取，并用乙醇沉淀。将纯化的RNA 溶于无RNA酶的ddH2O中，用光谱仪定量分析。
[0015]优选的，所述S2中，血管内皮生长因子A的NCBI参考序列为 NM_001171628.1。
[0016]优选的，所述S2中，20μLPCR反应体系为10μL2
×
预混Taq， 500nM UP1，500nM UP2，10ng重组质粒DNA。
[0017]优选的，所述S2中，PCR反应程序为95℃5分钟，30个循环， 95℃30秒，60℃20秒，72℃60秒，72℃5分钟。
[0018]优选的，所述S3中，PCR反应程序为95℃10分钟，40个循环， 95℃15秒，60℃1分钟。
[0019]优选的，所述S2和S3中，PCR反应均在实时PCR仪StepOne plus 上进行。
[0020]优选的，所述S4中，对Cas9
‑
sgRNA位点特异性进行检测包括 对单碱基突变的检测能力、单碱基突变是否可以用CARP、 Cas9
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sgRNA对靶DNA单碱基突变的切割效率、sgRNA单碱基错配 对切割效率的影响和不同sgRNAs对切割效率的影响。
[0021]与相关技术相比较，本专利技术提供的基于反向PCR技术检测 CRISPR
‑
Cas9位点特异性的方法具有如下有益效果：
[0022]1)通过一对Cas9
‑
sgRNA复合物对目标DNA进行特异性切割， 然后用T4 DNA连接酶将切割产物连接起来，最后进行PCR反应， 巧妙地设计了一对反向引物用来扩增目标DNA；
[0023]2)通过检测各种位点突变和评价sgRNA序列的亲和力，充分验 证了该方法的可行性；
[0024]3)基于PCR的检测方法可以直接在PCR的传统反应条件下使 用，不需要另外建立检测系统。因此，在具备PCR仪的实验室中很 容易推广；
[0025]4)由于使基于反向PCR技术，因此对DNA的扩增效率极高；
[0026]5)最小检测量为0.02ng，具有足够高的灵敏度来检测低浓度底 物DNA，且耗时少。
附图说明
[0027]图1为本专利技术中CARP检测示意图；
[0028]图2为本专利技术中用于合成sgRNAs转录模板并进行PCR的寡核 苷酸序；
[0029]图3为本专利技术中sgRNA制备时琼脂糖凝胶电泳检测示意图；
[0030]图4为本专利技术中单碱基突变的CARP检测示意图；
[0031]图5为本专利技术中通过CARP检测单碱基突变的示意图；
[0032]图6为本专利技术中基于qPCR的CARP检测Cas9
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sgRNA的单核苷 酸特异性的示意图；
[0033]图7为本专利技术中通过基于qPCR的CARPS评估gRNA的单核苷 酸特异性的示意图；
[0034]图8为本专利技术中同时探讨不同的sgRNAs对切割效率的影响的示 意图。
具体实施方式
[0035]下面结合附图和实施方式对本专利技术作进一步说明。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于反向PCR技术检测CRISPR
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Cas9位点特异性的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：sgRNA制备，首先将两条互补链退火并延伸，生成通用sgRNA框架模板，然后通过融合PCR，将20bp与目标DNA互补的特异性序列加入到通用sgRNA框架模板中，其次，通过融合PCR，将T7启动子序列加入上一步的扩增产物中，最后，通过体外转录合成sgRNAs；S2：底物DNA制备，将血管内皮生长因子A的CDS合成并整合到pUC57质粒中，用与pUC57质粒序列互补的通用引物UP1和UP2扩增所有底物DNA，在20μLPCR反应体系下重组质粒DNA，然后通过PCR反应，获得PCR产物，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳纯化，纯化后的DNA片段用NanoDrop分光光度计定量，制得所述底物DNA；S3：反向PCR，将S1所述的sgRNA进行预孵化，获得预孵化产物Cas9
‑
sgRNA复合物，将S2所述的底物DNA与预孵化产物混合，在37℃下进行切割5min，然后将切割产物与T4连接酶连接，最后进行定量PCR反应；S4：对Cas9
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sgRNA位点特异性进行检测。2.根据权利要求1所述的基于反向PCR技术检测CRISPR
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Cas9位点特异性的方法，其特征在于，所述S1中，转录反应是将纯化后的产物与RNA转录试剂在37℃下孵育过夜。3.根据权利要求2所述的基于反向PCR技术检测CRISPR
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Cas9位点特异性的方法，其特征在于，所述转录试剂为T7 RNA聚合酶、缓冲液和rNTPs。4.根据权利要求1所述的基于反向PCR技术检测CRISPR
‑
Cas9位点特异性的方法，其特征在于，所述S1还包括以下步骤：将转录产物与Trizol溶液混合，然后先后用氯仿和异丙醇提取，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贝贝，李苗，魏圆梦，周佳木，王娇娇，但汉东，王艳歌，史平玲，李晓丽，黄子旭，唐贺，宋宗明，
申请(专利权)人：河南省人民医院，
类型：发明
国别省市：