使用βig-h3蛋白质的诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及用于测量β　　ｉｇ－ｈ３蛋白质的量的方法以及使用该方法的诊断试剂盒。具体而言，本发明专利技术涉及通过β　　ｉｇ－ｈ３蛋白质或β　　ｉｇ－ｈ３蛋白质中ｆａｓ－１结构域的重组蛋白（包括其片段或其衍生物）与其配体之间的特异结合反应来测量体液中βｉｇ－ｈ３蛋白质的量的方法，还涉及用于肾病、肝病、类风湿性关节炎或心血管疾病的诊断试剂盒，其包含β　　ｉｇ－ｈ３蛋白质或β　　ｉｇ－ｈ３蛋白质中ｆａｓ－１结构域的重组蛋白（包括其片段或其衍生物）及其配体。本发明专利技术的方法和试剂盒能够有效的作为用于诊断肾病、肝病、类风湿性关节炎或心血管疾病的损伤和发展程度的灵敏诊断方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于测量βig-h3蛋白质的量的方法以及使用其的诊断试剂盒。具体而言，本专利技术涉及通过βig-h3蛋白质或βig-h3蛋白质中fas-1结构域的重组蛋白(包括其片段或其衍生物)与其配体之间的特异结合反应来测量体液中βig-h3蛋白质的量的方法，还涉及用于肾病、肝病、类风湿性关节炎或心血管疾病的诊断试剂盒，其包含βig-h3蛋白质或βig-h3蛋白质中fas-1结构域的重组蛋白(包括其片段或其衍生物)及其配体。
技术介绍
βig-h3是包括人黑素瘤细胞、乳房上皮细胞、角质细胞和肺成纤维细胞在内的多种细胞中由TGF-β诱导的胞外基质蛋白。TGF-β(转化生长因子-β)涉及多种细胞的生长和分化，而且哺乳动物具有三种TGF-β(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)。已知TGF-β具有许多复杂的功能，诸如生长控制、免疫应答调节、刺激骨形成、诱导软骨特异大分子、刺激伤口愈合等(Bennett，N.T.等人，Am.J.Surg.，1993，165，728)。TGF-β在伤口愈合过程中表达于上皮细胞中，可能是为了在上皮细胞再生过程中刺激角质细胞中整合素的表达。最近关于TGF-β表达的研究揭示了，TGF-β3mRNA表达于正常皮肤的上皮细胞和急性或慢性伤口恢复中的上皮细胞，TGF-β1mRNA只表达于由急性伤口再生的上皮细胞中，而TGF-β2mRNA根本不表达(Schmid，P.等人，J.Pathol.，1993，171，191)。尽管关于上述机制的具体理论尚未建立，但是认为TGF-β在上皮细胞再生中发挥重要作用。βig-h3，即由TGF-β诱导的基因h3，是由Stonier等人首先发现的。确切的说，βig-h3是在搜索来自A549细胞系的cDNA文库差异筛选数据的过程中发现的，A549细胞系是经过TGF-β1处理的人肺腺癌细胞系，据报道在TGF-β1处理后两天βig-h3升高了20倍(Stonier，J.等人，DNACell Biol.，1992，11，511)。还通过DNA测序确认了βig-h3是由SEQ.ID.No 1所示的683个氨基酸组成的，具有氨基末端分泌序列和能够进行针对某些整合素的配体识别的羧基末端Arg-Gly-Asp(RGD)序列。βig-h3包含四个同型内部重复结构域以及RGD基元，在哺乳动物、昆虫、海胆、植物、酵母和细菌等物种的膜蛋白或分泌蛋白中都能观察到这种高度保守的序列。诸如骨膜蛋白(periostin)、成束蛋白I、海胆HLC-2、海藻CAM和分支杆菌MPB70等蛋白质也包含上述保守序列(Kawamoto，T.等人，Biochem.Biophys.Acta.，1998，1395，288)。在那些蛋白质中非常保守的同型结构域(在下文中称为“fas-1结构域”)由110-140个氨基酸组成，包含两个各由10个氨基酸组成的非常保守的分支(H1和H2)。βig-h3、骨膜蛋白和成束蛋白I含有4个fas-1结构域，HCL-2含有2个fas-1结构域，而MPB70则只含有1个fas-1结构域。已知那些蛋白质中的一些可以作为细胞粘附分子而介导细胞的粘附和脱离，尽管尚未能够完全解释那些蛋白质的生物学功能。例如，βig-h3、骨膜蛋白和成束蛋白I分别干预成纤维细胞、成骨细胞和神经细胞的粘附，而则证实海藻-CAM是在团藻胚中驻留的细胞粘附分子(LeBaron，R.G.等人，J.Invest.Dermatol.，104，844，1995；Horiuchi，K.等人，J.Bone Miner.Res.，1999，14，1239；Huber，O.等人，EMBO J.，1994，13，4212)。纯化的βig-h3蛋白质在无血清培养基中刺激皮肤成纤维细胞的粘附和铺展，但是阻碍A549、HeLa和WI-38细胞的粘附。βig-h3尤其阻碍肿瘤细胞的生长、集落的形成和出现。事实上，通过用βig-h3表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞，肿瘤细胞在裸鼠中的生长显著降低，这在美国专利#5,714,588和#5,599,788中有明确叙述。此外，在那些专利中还叙述了通过用需要量的βig-h3接触伤口来刺激受伤部位周围的成纤维细胞扩展和粘附的方法。因此，作为在许多细胞中由TGF-β高度诱导的细胞粘附分子，βig-h3在细胞生长、细胞分化、伤口愈合、形态发生和细胞粘附中发挥重要作用。尽管βig-h3是有效的有用物质，然而因为人体内只生成极少量的βig-h3，所以它的供应是不足的。为了解决这个问题，通过遗传工程在真核细胞系统中表达βig-h3，从而开发了制备它的方法。可是，在那种情况中，生成βig-h3的细胞的生长比其它细胞慢得多，从而导致难以获得足够量的βig-h3生成细胞。因此，本专利技术人建立了一种纯化方法，其中使用大肠杆菌作为宿主大量表达包含整个βig-h3蛋白质或其一些结构域的重组蛋白，证实了那些重组蛋白支持细胞粘附和铺展，并申请了专利(韩国专利申请#2000-25664)。细胞粘附分子βig-h3的细胞粘附活性首先报导于人的真皮成纤维细胞，然后在软骨细胞、腹膜成纤维细胞和人MRC5成纤维细胞中也有这样的报导。早期认为βig-h3的细胞粘附活性是由βig-h3羧基末端的RGD基元介导的。但是后来报导RGD基元并非是刺激软骨细胞铺展所必需的，而且通过羧基末端加工使其中RGD基元缺失的成熟βig-h3能够阻碍细胞粘附。因此，确认了RGD基元并非βig-h3细胞粘附活性的必需介导物。最近的研究进一步确认了βig-h3通过与整合素α1β1独立作用来刺激细胞粘附和铺展，尤其是成纤维细胞的铺展，而βig-h3的RGD基元并非由βig-h3介导的细胞铺展所必需的(Ohno，S.等人，Biochim.Biophys.Acta，1999，1451，196)。此外，确认了βig-h3中所包含的H1和H2肽不影响由βig-h3介导的细胞粘附，说明细胞粘附所需要的某些氨基酸并非位于H1和H2中而是在βig-h3的其它部位。为了支持上文，通过计算机分析了βig-h3的重复fas-1结构域与其它蛋白质的fas-1结构域之间的同源性，从而确认了βig-h3中除了H1和H2以外的许多其它保守氨基酸参与细胞粘附的事实。因此，本专利技术人试图寻找参与细胞粘附和脱离活性的保守基元，并制备包含它们的肽。结果是，本专利技术人使用称为细胞粘附分子的βig-h3的第二个和第四个结构域制备了通过与α3β1整合素一起作用来介导细胞粘附和脱离的肽NKDIL、EPDIM和它们的衍生物，并揭示了位于βig-h3第二个和第四个结构域中H2区域附近的两个非常保守的氨基酸，天冬氨酸(Asp)和异亮氨酸(Ile)是细胞粘附和脱离所必需的氨基酸，并申请了专利(韩国专利申请#2000-25665)。今天，尚无βig-h3直接涉及疾病的报导，但是βig-h3似乎涉及一些人类癌症。尚未能够解释βig-h3表达与肾病、肝病、类风湿性关节炎和心血管疾病发展的关联，同样尚未报导通过测量体液中βig-h3蛋白质的量即利用βig-h3蛋白质诊断疾病的可能性。由此，本专利技术人开发了使用通过将许多βig-h3或βig-h3的第四个fas-1结构域连接起来而制备的重组蛋白作为标准蛋白而测量βig-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于测量βｉｇ－ｈ３蛋白质的量的方法，其包括以下步骤：１）制备βｉｇ－ｈ３或βｉｇ－ｈ３ｆａｓ－１结构域的重组蛋白、其片段或衍生物；２）制备针对上述步骤１的上述重组蛋白、其片段或衍生物的特异配体；和３）通过使用上述步骤２的配体与上述步骤１的重组蛋白、其片段或衍生物的结合反应的方法来测量样品的βｉｇ－ｈ３蛋白质的量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：金仁山，裴宗燮，
申请(专利权)人：再生生命工学会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]