显示细胞附着,铺展和脱附活性的肽和它们的衍生物制造技术

本发明专利技术涉及显示细胞附着，铺展和脱附活性的肽和它们的衍生物。特别地，本发明专利技术涉及肽ＮＫＤＩＬ和ＥＰＤＩＭ和它们的衍生物，它们通过与作为功能细胞受体的α３β１整联蛋白相互作用促进细胞附着活性，并且包括对于细胞附着和脱附活性必需的天冬氨酸和异亮氨酸。本发明专利技术的肽和它们衍生物可用于开展通过各种胞外基质蛋白，包括βｉｇ－ｈ３介导的细胞附着活性，创伤愈合，组织再生和转移抑制的研究。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,铺展和脱附活性的肽和它们的衍生物的制作方法
本专利技术涉及，铺展(spreading)和脱附活性的肽和它们的衍生物。特别地，本专利技术涉及肽NKDIL和EPDIIM和它们的衍生物，它们通过与作为功能细胞受体的α3β1整联蛋白相互作用促进细胞附着活性，并包括对于细胞附着和脱附活性必需的天冬氨酸和异亮氨酸。由于在各种细胞系中，TGF-β提高βig-h3基因的表达水平，并且在由TGF-β控制增殖率的各种细胞系中该基因被诱导，由此认为在介导TGF-β的某些信号途径中涉及βig-h3。相反，报道在从局部肢骨纹状肥大的骨肥厚的皮肤损伤、某些肿瘤细胞和地塞米松处理的干细胞培养的成纤维细胞中βig-h3的表达被降低。因此，在各种组织中，在形态发生和与细胞和其它胞外基质蛋白的相互作用过程中，βig-h3扮演着重要的角色。另外，已知βig-h3作为一种细胞粘附分子介导细胞的附着和脱附。发现在无血清的培养基中，纯化的βig-h3蛋白促进皮肤成纤维细胞的附着和铺展，而抑制A549、HeLa和Wi-38细胞的粘附。特别地，已知βig-h3具有抑制肿瘤细胞生长和群体形成的活性。事实上，报道了βig-h3显著抑制裸鼠中CHO(中国仓鼠卵巢)细胞的生长。而且，在发现对创伤施用药物有效量的βig-h3使得细胞，尤其是成纤维细胞覆盖并粘附在创伤部位的基础上，发展了一种创伤愈合方法。结果，在各种细胞系中由TGF-β诱导的βig-h3，一种细胞粘附分子，在细胞生长，细胞分化，创伤愈合，形态发生和细胞粘附过程中扮演非常重要的角色。βig-h3包含四个具有内部同源性的140个氨基酸重复。在各种物种，包括哺乳动物，昆虫，海胆，植物，酵母和细菌的分泌蛋白或膜蛋白中，发现内部重复结构域具有高度保守的序列。蛋白例如periostin，成束蛋白I，海胆HLC-2，藻类-CAM和分枝菌属MPB70是包含保守序列的实例。在这些蛋白中保守的同源结构域(下文指“fas-1”)由约110-140个氨基酸组成，该氨基酸具有两个高度保守的H1和H2支链，每个支链具有约10个氨基酸。发现在βig-h3、periostin和成束蛋白I中有四个fas-1结构域，在HLC-2中有两个fas-1结构域，在MPB70中仅有一个fas-l结构域。尽管这些蛋白的功能没有清楚地阐明，但已知它们中的一些充当细胞粘附分子。例如，报道了βig-h3，periostin和成束蛋白I分别介导成纤维细胞，成骨细胞，和神经细胞的粘附。另外，公开了藻类-CAM是存在于藻类团藻属(algae Volvox)胚胎中的细胞粘附分子。首先在人皮成纤维细胞中发现了βig-h3的细胞附着活性，然后在软骨细胞，腹膜成纤维细胞和人MRC5成纤维细胞中也发现了βig-h3的细胞附着活性。最初，认为C末端的RGD基序介导β3ig-h3的细胞附着活性。然而，一些研究结果揭示RGD基序不是促进软骨细胞铺展所必需的，并且通过羧基末端加工缺失RGD基序的成熟可溶βig-h3能抑制细胞粘附，由此产生了一个结论，即对于βig-h3的介导细胞附着活性而言，βig-h3的RGD基序不是必需的。另外，近来已报道了通过整联蛋白α1β1，βig-h3促进成纤维细胞的铺展，而βig-h3的RGD基序对于βig-h3-介导的细胞铺展不是必需的。而且，βig-h3的保守肽H1和H2不抑制βig-h3-介导的细胞粘附，使得保守肽对于βig-h3介导的细胞附着是无效的。将这些结果综合在一起，表明存在于除了H1和H2以外区域中的氨基酸对于βig-h3的细胞附着活性是必需的。其它蛋白的fas-1结构域之间，以及βig-h3的重复的fas-1结构域之间同源性的计算机分析揭示除了H1和H2肽以外，还存在几个高度保守的氨基酸序列，提示在细胞附着活性中涉及保守的氨基酸序列的可能性。因此，本专利技术的一个目的是提供肽和它们的衍生物，其包含对于细胞附着，铺展和脱附活性必需的保守的氨基酸序列。本专利技术的另一个目的是提供一种用于创伤愈合，组织再生和抗癌症转移的药物组合物。按照本专利技术的一个实施方案，提供了一种肽和它的衍生物，该肽具有细胞附着，铺展和脱附活性，包含用下列单字母符号XXDIX表示的氨基酸序列，其中X是20种常见氨基酸的任何一种，D代表天冬氨酸，I代表异亮氨酸。按照本专利技术的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含作为药物活性成分的上述肽或它的衍生物。附图说明图1b是表示衍生自βig-h3 fas-1结构域的重组蛋白的SDS-PAGE结果的照片。图2是表示衍生自βig-h3 fas-1结构域的重组蛋白的细胞附着活性的直方图。图3是表示抗整联蛋白抗体对衍生自βig-h3 fas-1结构域的重组蛋白的细胞附着活性的抑制活性的直方图。图4是表示包含fas-1结构域的各种基质蛋白的氨基酸序列。图5a是表示衍生自βig-h3第四fas-1结构域的取代突变型的示意图。图5b是表示衍生自βig-h3第四fas-1结构域的取代突变型的15％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的照片。图6是表示衍生自βig-h3第四fas-1结构域的取代突变型的细胞附着活性的直方图。图7表示本专利技术合成肽的氨基酸序列。图8a是表示合成肽对HCE细胞粘附的抑制活性的直方图。图8b是表示合成的βig-h3肽抑制HCE细胞粘附到βig-h3 D-II或βig-h3D-IV蛋白上的直方图。图9a是表示按照本专利技术的合成肽的HCE细胞附着活性的曲线图。图9b是表示抗整联蛋白抗体抑制HCE细胞粘附到合成肽EPDIM和NKDIL上的直方图。图10a是表示本专利技术合成肽对HCE细胞粘附到几种胞外基质蛋白上的作用的直方图。图10b是表示在存在各种浓度EPDIM的条件下，HCE细胞粘附到用胞外基质蛋白包被的表面上的剂量依赖抑制的曲线图。专利技术详述在本专利技术中，基于不但包含4个fas-1结构域的βig-h3，而且单独的第二结构域或第四结构域也可介导细胞附着活性的发现，利用已知介导细胞附着活性的βig-h3氨基酸序列来制备包含对细胞附着和铺展活性必需的保守序列的肽。更详细地，如图1a所示，合成βig-h3基因的四个不同截短的DNA片段，即βig-h3 D-I，βig-h3 D-II，βig-h3 D-III和βig-h3 D-IV，其分别编码第一至第四内部重复结构域。表示得到的四个重组蛋白的细胞附着和铺展活性的定量测定证实仅四个fas-1结构域的第二或第四结构域可介导βig-h3的细胞附着和铺展活性，如图2所示，表明在该两个结构域中存在对于介导细胞附着和铺展而言必需的氨基酸。相比之下，βig-h3的第一结构域显示中等细胞附着和铺展活性，而在第三结构域中未发现细胞附着活性。另外，按照本专利技术，确定了α3β1整联蛋白是βig-h3的第二和第四结构域的功能受体。使用包含βig-h3第二和第四结构域的截短的蛋白，每个结构域，铺展和脱附活性，本专利技术人检验了βig-h3的受体。如图3所示，第二或第四fas-1结构域介导的细胞附着活性几乎完全被抗α3和β1整联蛋白亚基的抗体所抑制。这些结果表示第二和第四fas-1结构域均结合到功能受体α3β1整联蛋白上，以介导细胞附着活性，并且具有对于介导细胞粘附活性而言必需的氨基酸。本专利技术还提供了肽，其包含对于βig-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肽和它的衍生物，其具有细胞附着，铺展和脱附活性，包含由ＸＸＤＩＸ表示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：金仁山，金廷恩，
申请(专利权)人：再生生命工学会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]