细胞粘附和创伤愈合的方法技术

本发明专利技术涉及一种用βｉｇ－ｈ３的内部结构域进行细胞粘附和创伤愈合的方法。特别地，本发明专利技术涉及使用重组蛋白进行细胞粘附和创伤愈合的方法，该重组蛋白包含一个或多个βｉｇ－ｈ３的第二或第四内部结构域，其中βｉｇ－ｈ３的第二或第四内部结构域具有与整联蛋白相互作用必需的天冬氨酸和异亮氨酸，这两种氨基酸在βｉｇ－ｈ３内部结构域的碱基序列中表现高度的同源性。该包含一个或多个βｉｇ－ｈ３的第二或第四内部结构域的重组蛋白本身对于细胞粘附和创伤愈合是有效的，并且可用于开发细胞培养基和创伤愈合剂。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于细胞粘附和创伤愈合的肽。更特别地，本专利技术涉及肽在细胞粘附和创伤愈合中的应用，该肽包含一个或多个拷贝的βig-h3的第二和/或第四fas-1结构域，所述第二和第四结构域在两种氨基酸，天冬氨酸和异亮氨酸上具有高度同源性，这两种氨基酸对于结合整联蛋白并且因此介导细胞粘附是必需的。另外，本专利技术涉及一种适于在细胞粘附和创伤愈合中有用的肽的表达系统。
技术介绍
βig-h3是一种胞外基质蛋白，在各种细胞系中，伴随着信号它的表达被活性TGF-β诱导，这些细胞系包括人黑素瘤细胞，乳房上皮细胞，角质细胞，和肺成纤维细胞(Skonier，J.等.，DNA细胞生物学(DNA CellBiol).13，571，1994)。通过从已被TGF-β处理的人肺腺癌细胞系制得的cDNA文库的示差杂交筛选，首次分离了βig-h3基因。βig-h3基因编码一种683-氨基酸蛋白，该蛋白在物种之间是高度保守的。它在N-末端含有一个分泌信号肽和在C-末端含有一个精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序。在很多胞外基质蛋白中发现调节细胞粘附的RGD基序，其作为几种整联蛋白的配体识别序列(Stonier，J.等.，DNA细胞生物学(DNA CellBiol).，11，511，1992)。根据几项研究，了解到在细胞生长和分化，创伤愈合，和细胞粘附过程中涉及βig-h3，尽管这些功能的潜在的机制还不清楚。然而，在各种组织中，在形态发生和与细胞和胞外基质蛋白的相互作用过程中，βig-h3似乎扮演着重要的角色。通过几项研究，提供了与βig-h3在介导细胞附着和脱附过程中的角色有关的一些证据。例如，发现在无血清培养基中，纯化的βig-h3蛋白促进皮肤成纤维细胞的附着和铺展，而抑制A549，HeLa和Wi-38细胞的粘附。特别地，已知βig-h3具有抑制肿瘤细胞生长的活性，并影响群体形成和形态学。该抑制活性被一项报道所证实，即在裸鼠中，将βig-h3表达质粒转染到CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中，导致细胞分化和这些细胞形成肿瘤细胞的能力明显降低。而且，在发现对创伤施用药物有效量的βig-h3，使得细胞，尤其是成纤维细胞覆盖并粘附在创伤部位的基础上，发展了一种创伤愈合方法。因此，在各种细胞系中由TGF-β诱导的βig-h3，一种细胞粘附分子，在细胞生长，细胞分化，创伤愈合，形态发生和细胞粘附过程中扮演非常重要的角色(Rawe，I.M.等.，眼科视觉科学研究(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.)38，893，1997；Lebaron，R.G.等.，J皮肤学研究(Invest.Dermatol.)104，844，1995)。βig-h3包含四个具有内部同源性的140个氨基酸重复，即fas-1结构域。在各种物种，包括哺乳动物，昆虫，海胆，植物，酵母和细菌的分泌蛋白或膜蛋白中，发现内部重复结构域具有高度保守的序列。包含保守序列的蛋白实例有periostin，成束蛋白I，海胆HLC-2，藻类-CAM和分枝菌属MPB70。在这些蛋白中的保守结构域(下文指“fas-1”)由约110-140个氨基酸组成，该氨基酸具有两个高度保守的支链，H1和H2，每个支链约有10个氨基酸(Kawamoto，T.等.，生物化学生物物理快报(Biochem.Biophys.Acta.)1395，288，1998)。发现在βig-h3、periostin和成束蛋白I中有四个fas-1结构域，在HLC-2中有两个fas-1结构域，在MPB70中仅有一个fas-1结构域。尽管这些蛋白的功能没有清楚地阐明，但已知它们中的一些充当细胞粘附分子。例如，报道了βig-h3，periostin和成束蛋白I分别介导成纤维细胞，成骨细胞，和神经细胞的粘附。另外，公开了藻类-CAM是存在于藻类团藻属(algaeVolvox)胚胎中的细胞粘附分子(LeBaron，R.G.，等.，J.Invest.Dermatol.104，844，1995；Horiuchi，K.等.，骨矿质研究(J.Bone Miner.Res.)14，1239，1999；Huber，O.等.，EMBO J.13，4212，1994)。最初，认为C末端的RGD基序介导βig-h3的细胞附着活性。然而，一些研究结果揭示RGD基序不是促进软骨细胞铺展所必需的，并且通过羧基末端加工缺失RGD基序的成熟可溶βig-h3能抑制细胞粘附，由此产生了一个结论，即对于βig-h3的介导细胞附着活性而言，βig-h3的RGD基序不是必需的。另外，近来已报道了通过整联蛋白α1β1，βig-h3促进成纤维细胞的铺展，而βig-h3的RGD基序对于βig-h3的介导细胞粘附的性能不是必需的。根据最近的报道，不考虑RGD基序，βig-h3特异地结合整联蛋白以增强细胞粘附和铺展(Ohno，S.等.，Biochm.Biophys.Acta1451，196，1999)。而且，发现βig-h3的保守肽H1和H2对βig-h3介导的细胞粘附无影响。综合这些结果，表明对于βig-h3的细胞附着活性必需的氨基酸存在于除了H1和H2区域以外的某个区域。基于不仅在βig-h3的重复fas-1结构域之间，而且在其它蛋白的fas-1结构域之间存在同源性的计算机研究揭示，除了H1和H2肽，存在几个高度保守的氨基酸，提示在细胞附着活性中涉及保守的氨基酸序列的可能性。按照本专利技术，已知在细胞粘附过程中扮演重要角色的βig-h3的结构域的第二或第四结构域的任何一个被鉴定为分子的细胞粘附所必需的最小结构域。基于这些发现，按照本专利技术，包含必需功能结构域的重组蛋白也被鉴定为对创伤愈合是有效的。近来创伤愈合研究已被细分为细胞生物学和分子生物学，并且创伤愈合的促进作用已经越来越多地应用到各种临床领域。然而，创伤愈合的细胞生物学和分子生物学机制仍然不清楚。根据迄今公开的发现，创伤愈合是对外伤的组织反应，通过复杂的生物学过程，包括趋化性、细胞分化和复制，基质蛋白合成，血管发生，和创伤恢复，导致组织修复(Steed，D.L.，等.，Clin.Plast.Surg.25，397，1998)。生长因子是在创伤愈合早期阶段出现的有代表性的物质，并且控制随后的创伤愈合过程。对创伤愈合的全部阶段具有强烈影响的生长因子控制细胞的生长，分化和新陈代谢，并且通过它们的趋化性能组织再生创伤环境，趋化性能吸引在炎症和组织修复，细胞增殖，刺激血管发生和胞外基质的合成和降解中涉及的各种细胞类型。PDGF(血小板衍生的生长因子)吸引成纤维细胞至创伤部位，并刺激它们增殖，并且转化生长因子-β(TGF-β)使得它们产生胶原。PDGF对在创伤愈合、刺激血管发生、重塑和收缩中涉及的大多数细胞具有趋化性，并激活创伤愈合细胞(Mustoe，T.A.等.，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)87，694，1991；Lepisto，J.等.，外科研究杂志(J.Surg.Res.)53，596，1992)。EGF(表皮生长因子)刺激角化细胞迁移，血管发生和肉芽组织发生，并激活角化细胞和成纤维细胞的有丝分裂(Franklin，J.D.等.，Plast.Recsonst.Surg.64，766，1979；Buckly，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用重组蛋白附着哺乳动物细胞的方法，该重组蛋白包含βｉｇ－ｈ３的一部分结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：金仁山，金廷恩，
申请(专利权)人：再生生命工学会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]