鉴定与跨膜蛋白相互作用的化合物的方法技术

本发明专利技术提供了一种筛选能与跨膜蛋白相互作用的化合物的方法，还提供了一种确定例如跨膜蛋白等蛋白质之间是否能够寡聚化的方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及筛选能够与跨膜蛋白相互作用的化合物的方法。本专利技术进一步涉及筛选能够二聚化或寡聚化形成两个或两个以上蛋白质复合体的跨膜蛋白的方法。
技术介绍
在下文的描述中，本说明书末尾列出了具体的参考文献，这些文献均以参见的方式引入本说明书中。跨膜蛋白分为几个主要类别，包括G蛋白偶联受体、转运蛋白、酪氨酸激酶受体、细胞因子受体和LDL(低密度脂蛋白)受体。根据结构和序列的同源性，可将G蛋白偶联受体(GPCR)分为几个家族。家族1(也称为家族A或视紫红质样家族)是到目前为止最大的亚类，其包括下列分子的受体小分子如儿茶酚胺、多巴胺和去甲肾上腺素，肽如阿片样物质、促生长素抑制素和血管加压素，糖蛋白激素如促甲状腺激素，刺激激素和增味剂分子的全部种类(George等，2002年)。家族2或称家族B包括例如胰高血糖素、甲状旁腺激素和胰液素的受体。这些GPCR的特征为均具有含有几个半胱氨酸的长氨基末端，所述半胱氨酸可形成二硫键桥。家族3或称家族C包括的受体例如促代谢型谷氨酸受体、Ca2+敏感性受体和γ氨基丁酸(GABA)B受体。上述受体也具有复杂的氨基末端的特征。虽然所有GPCR均具有七次跨膜(TM)螺旋，但是各个GPCR家族之间并没有序列同源性。GPCR是已知的最大的一类细胞表面信号传导的中介分子，其分布在体内的每个细胞上。GPCR的作用调节了全部生理功能，例如包括脑、心脏、肾、肺、免疫系统和内分泌系统的功能。过去10年中的大量努力鉴定出了许多新的GPCR，包括先前已知配体的多受体亚型和尚未鉴定出内源性配体的许多受体，后者称为“孤儿”受体或oGPCR(Lee等，2001年；Lee等，2002年；Bailey等，2001年)。目前，GPCR已经成为临床上用于治疗各种疾病的许多药物的成功靶点，估计当前市场上约50％药物的靶向这些分子。在已知的GPCR中，大约335种受体是药物开发的潜在靶点，其中195种的配体已知，剩余的140种为oGPCR，后者的配体等待鉴定。尽管各种方法学上的进步加速了发现新受体的速度，但是发现配体和药物的速度却远远落后了。虽然常规的、小规模的药理学筛选分析方法最初被用于发现许多GPCR的配体和药物，但是人们一直在寻找更为新颖的分析方法。由于超过80％的细胞表面受体是GPCR，因此其成为新药开发的丰富资源，并构成了与新药开发高度相关的蛋白靶点群。因为GPCR与药物之间的相互作用可被限制在仅具有所述受体的细胞表面和组织上，所以与GPCR相互作用的药物具有高度选择性的潜能。发现GPCR并意识到其是重要的药物靶点，这一点引起了人们在制药学方面的强烈兴趣，该兴趣在于设计出检测和筛选与GPCR相互作用的化合物的更好方法。因而，为了实现以更快的速度筛选和发现药物的目标，迫切需要开发一些改良的分析方法。需要将检测受试化合物和所述受体之间相互作用的能力最优化，这是药物开发过程中最初的基础步骤。用以加速鉴定全部GPCR的改良的配体鉴定策略将对所述受体的生理功能进行定义，人们并认识到其在发现新药中的潜能。尽管明确了的药物靶点中蕴藏着巨大财富，但是即使在经过鉴定的GPCR中，也只发现少量高选择性亚型特异性的药物，而制药机构也正面临着缺乏有前途的先导化合物的局面。与前3年相比，在1999-2001年的三年中，排名前20的制药公司认可的新药产品的数量显著减少(Smith，2002年)。因此，确实需要改良的多用途的分析系统，该系统能够以快速有效的方式测试和鉴定内源性配体和与所述受体相互作用的新化合物，并且该系统适于自动化。由于无法预测需要激活oGPCR的信号传导通路，因此需要一套检测所述受体与化合物相互作用的分析系统，该系统独立于前述预测，其中，所述受体激活了效应器系统(例如腺苷酸环化酶、PLC(磷脂酶C)、cGMP(环鸟苷酸单磷酸)和磷酸二酯酶的活性)。将配体与GPCR和oGPCR配对是一项重要的工作；然而，GPCR配体和效应器系统的多样性会限制一些已有的配体鉴定分析方法的使用，因此需要新的方法来发现药物。最近，几种采用精密分析系统的方法检测了组织提取物、大配体库和感兴趣的特定配体，成功地发现了许多所述oGPCR的内源性配体。所述方法收集在参考文献“反向药理学(Reverse Pharmacology)”(Howard等，2001年)中。各种检测方法被用来分析细胞针对一种激动剂化合物而诱导出来的活性，这些方法包括荧光成像板读数器(FluorescenceImaging Plate Reader)分析方法(FLIPR，分子设备公司(Molecular DevicesCorp.)，桑尼维尔(Sunnyvale)，加利福亚州)和Barak等人(1997年)，以及专利号为5,891,646和6,110,693的美国专利公开的以下方法在刺激GPCR的条件下，使用β-视紫红质抑制蛋白(arrestin)-绿色荧光融合蛋白对视紫红质抑制蛋白向细胞表面的转位进行成像。所述方法的潜在缺陷在于(1)成像结果并非受体本身；(2)蛋白转位的成像需要复杂的计算机分析技术；(3)筛选拮抗剂之前必需鉴定出激动剂；和(4)信号传导的发生必需存在特异性G蛋白偶联。传统的GPCR的配体结合和信号传导的模型建立在单受体参与所述过程的假设上，并且该GPCR的单受体模型已经被广泛接受。然而，从20世纪90年代中期开始，大量的报道证实了许多GPCR的寡聚化现象(George等的综述，2002年)，并且目前已认识到寡聚化现象是GPCR结构和生物学功能的一个固有特性。某些受体亚型也会形成异源寡聚体，而这些所述受体的功能特征与同源受体群有所不同。目前，对GPCR寡聚化现象的研究并没有发现二聚体和更大复合物之间的差别，因此“二聚体”一词是可以与“寡聚体”和“多聚体”互换的。并没有结论性的数据能够确定功能性的GPCR的寡聚体有多大。重要的是，通过异源寡聚化作用产生的新特性表明了GPCR产生多种功能的机制。GPCR的同源寡聚化作用作为一种普遍存在的现象而被接受了，而大量GPCR已知能够组装形成异源寡聚体受体复合物(George等，2002年)。例如，GABA-B1和GABA-B2受体的单体没有功能，而只有在共表达时才会形成功能性受体(White等，1998年)。异源寡聚体受体复合物的组装可形成新的受体-配体结合、信号传导或细胞内转运特性。例如，共转染μ和δ阿片受体导致具有功能性特征的寡聚体的形成，所述功能性特征不同于两种单个受体的任何一种的功能特征(George等，2000年)。μ和δ阿片受体相互作用形成的寡聚体产生了新的药理学特性和G蛋白偶联特性。当μ和δ阿片受体同时表达时，高选择性的激动剂(DAMGO、DPDPE和吗啡)的效能降低，且发生效能排序的改变，而某些内源性配体内吗啡肽1(endomorphin-1)和亮啡肽(Leu-enkephalin)的亲和力增加，上述现象表明形成了新的配体结合袋(George等，2000年)。与单独表达的μ和δ受体不同，共表达所述受体显示出对百日咳毒素不敏感的信号传导，该现象可能是由于与不同亚型的G蛋白相互作用引起。因此，从鉴定潜在的药物靶点，到寻找确定一对特定GPCR能否形成异源寡聚体的方法来看，上述现象都是非常有用的。在很本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选能够与至少一种跨膜蛋白相互作用的候选化合物的方法，该方法包括：　　　　用至少一段编码蛋白质的核苷酸序列转染细胞，并允许在该细胞中表达编码的蛋白质，所述蛋白质包含有跨膜蛋白，该跨膜蛋白包含至少一个核定位序列和可检测成分；　　　　将所述细胞与候选化合物接触；和　　　　通过检测细胞中可检测成分的分布情况，来确定该细胞中所述表达蛋白质的分布情况；　　　　其中，如果检测发现，相对于未接触候选化合物的对照细胞中的可检测成分的分布情况，所述细胞中可检测成分的分布情况发生改变，则表明所述化合物与跨膜蛋白发生相互作用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：布赖恩F奥当德，苏珊R乔治，
申请(专利权)人：布赖恩F奥当德，苏珊R乔治，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]