使用氨基糖苷类抗生素检测PRP的方法技术

一种检测ＰｒＰ、特别是ＰｒＰ↑［ｓｃ］的方法，其特征在于使源自或获自动物或人类生物体的组织或生物学液体接触抗生素，该抗生素优选选自氨基糖苷类家族。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种通过硫酸链霉素完全沉淀PrPsc的方法及其在免疫检测或从液体或溶液中除去PrPsc中的应用。作为细胞朊病毒蛋白的天然或正常朊病毒蛋白，被命名为PrP或PrPc，是一种在哺乳动物的淋巴细胞和神经细胞中广泛表达的糖蛋白。PrPc的构象变化导致了有蛋白酶K抗性的PrPc的蛋白病原体的出现和增殖。将这种蛋白病原体一般称为PrPsc或者PrPres。PrPsc在动物器官内的积聚是多种疾病的起源，尤其是小型反刍动物的震颤病，麋鹿和羚羊的慢性恶病质病(或者慢性消耗性病“CWD”)，牛的海绵状脑病(ESB)和人的克-雅二氏病(MCJ)。感染了ESB的牛在2至6年的潜伏期后才有延迟表现并且病症发展缓慢，大大地减慢了流行病学模型的进展。ESB通过摄食传染人类，导致了一种新型克-雅二氏病(vMJC)的出现。在发病以前看起来很健康的被感染动物体内，尤其是患病动物的血液或尿液中很难检测到蛋白病原体PrPsc。目前，已确认人在摄取被感染组织时，用于人类消费目的的动物中的PrPsc将传染人类。因此，公共卫生的一个主要目标是通过检测用于人类消费目的的动物体内PrPsc的存在以便将它们从食物链中除去，从而避免传染。因此，检测生物学样品或动物体内PrPsc的存在已经变得极为重要，几个研究组正在研制免疫检测方法(WO02/086511)。此外，为了治疗vMJC，联合使用肽、小分子或PrPsc抑制剂的方法组成了热点研究的主题。然而，当生物样品中PrPsc的含量很低时，现有技术的方法总是难以通过可靠的方式鉴定PrPsc。本专利技术人已经证明氨基糖苷，优选II类(group II)氨基糖苷，更优选链霉素的一种新特性，证实了抗生素与PrPsc形成复合体并使之沉淀的能力。因此，本专利技术人观察到向多种动物来源且含有朊病毒的生物学样品中加入氨基糖苷后，致使朊病毒的3条带表观分子量增加。观察的结果和随后的试验使专利技术人证实了氨基糖苷能与PrPsc形成复合体，这种复合能够沉淀PrPsc，使得相对于本领域技术人员所用的常规方法而言检出PrPsc的可能性显著增加。因而，本专利技术的目的涉及通过沉淀浓缩PrPsc的方法，用于诊断朊病毒引起的疾病或者除去生物学液体中的朊病毒，其特征在于使源自或获自动物或人类生物体的组织悬液或生物学液体悬液接触抗生素，该抗生素优选选自氨基糖苷类家族，更优选链霉素。更准确地说，根据本专利技术的方法包括如下步骤a)向源自或获自动物或人类生物体的组织悬液或生物学液体悬液中加入一种氨基糖苷，b)将该溶液置于合适的缓冲液中并加热，然后离心得到的溶液，使底部和上清分离，c)电泳凝胶迁移、转移和免疫检测后检测PrPsc。本专利技术的方法也可包括使用一定剂量的蛋白酶，尤其是蛋白酶K消化样品的附加步骤。因而，本专利技术的方法包括如下步骤a)向源自或获自动物或人类生物体的组织悬液或生物学液体悬液中加入蛋白酶，例如蛋白酶K，b)加入一种氨基糖苷，c)将该溶液置于合适的缓冲液中并加热，然后离心得到的溶液，使底部和上清分离，d)电泳凝胶迁移、转移和免疫检测后检测PrPsc。更准确地说，本专利技术的方法包括如下步骤a)在5％葡萄糖溶液中匀浆获自动物或人类生物体的生物学液体或组织，制备10％的悬液，b)向100μl得到的悬液中加入蛋白酶K，然后在37℃孵育一小时，c)向悬液中加入一种氨基糖苷，然后在37℃再孵育一小时，d)将该溶液置于合适的缓冲液中并加热，再离心得到的溶液，使底部和上清分离，e)将底部悬浮于50μl 50％v/v 8M的尿素溶液和Laemmli变性缓冲液中，该缓冲液如Laemmli，Nature 227(1970)，680-685所述。剧烈旋涡振荡后，混合物在100℃加热5分钟，12,000g离心，回收上清夜用于SDS-PAGE迁移，f)在电泳凝胶上迁移后，尤其是在如Laemmli，Nature 227(1970)，680-685记载的15％的聚丙烯酰胺十二烷基硫酸盐凝胶上的单向电泳后，蛋白质通过电泳转移到硝酸纤维素膜上，然后在室温与识别由126-160个氨基酸组成的特异表位的单克隆抗体免疫印迹60分钟。二抗(1/5000)是与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠免疫球蛋白的重链和轻链的山羊抗体(IgG H+L)；洗涤印迹膜，使用ECL试剂盒(Amersham)在胶片(Biomex light，Kodak)上检测信号或者使用super Signal Ultra(Pierce)通过化学发光并在Fluor S.Multimager(BioRad)显色检测信号。根据本专利技术的方法具有不需要超速离心的优点。根据本专利技术的方法还涉及朊病毒蛋白与氨基糖苷形成复合体并通过氨基糖苷沉淀朊病毒蛋白。根据本专利技术的实施方案，生物学组织源自或获自大脑，或其它动物或人体组织，或获自生物学液体，比如脑脊液或血清。本专利技术方法所用蛋白酶是根据它消化存在的朊病毒蛋白的能力进行选择，包括其消化朊病毒蛋白的正常形式的能力，并且该酶不具备消化这个蛋白的病理形式的能力。优选蛋白酶K。根据本专利技术优选的实施方案，组织在与所述氨基糖苷接触之前在葡萄糖溶液中匀浆。优选用5％的葡萄糖溶液。向生物学样品与蛋白酶K和氨基糖苷作用得到的悬液中加入100μlLaemmli缓冲液后，加热步骤相应于温度升高60-150℃，优选约100℃。根据本专利技术优选的实施方案，氨基糖苷是II类氨基糖苷，优选链霉素或其衍生物。本专利技术也涉及所述氨基糖苷在PrPsc的沉淀、检测甚至免疫组织化学检测和/或诊断中的应用。本专利技术也涉及所述氨基糖苷用于从生物学液体中除去PrPsc的应用。最后，本专利技术也涉及用于诊断与PrPsc有关的病变的试剂盒，其特征在于含有所述氨基糖苷。以下实施例涉及当生物学样品与氨基糖苷接触时对Pcrsc的检测的放大作用，阅读这些实施例后可显而易见本专利技术的的其它优点和特征。实施例中的参照图见后面的附图。附图说明图1A是感染了震颤病的绵羊脑样品中的PrPsc在不同数量的链霉素存在时，经15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移和免疫检测后检测结果的比较实施例。图1B是与递增数量的链霉素混合前后，图1中每条PrPsc带测得的平均分子量的比较图。图2是含有很多蛋白PrPsc的悬液在存在和不存在不同数量的链霉素时，经第二个小时孵育后，对比上清和沉淀中的PrPsc经15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移和免疫检测后检测的实施例。图3显示了向含有少量PrPsc的悬液中同时加入蛋白酶K和链霉素，结果是上清中的PrPsc消失，而沉淀中出现了PrPsc。图4A，4B和4C显示了经15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移和免疫检测后，当加入的链霉素量增加时，PrPsc的检测阈值增加。图5中的表涉及实施例5，显示了使用本专利技术技术与使用参考技术获得的97个动物脑中PrPsc的诊断结果的比较。图6显示了用扫描探针显微镜(scanning probe microscopy，SPM)以非接触模式得到的只有重组蛋白朊病毒(recPrP)(A)，有链霉素存在时的recPrP(B)和只有链霉素(C)的烘干胶片(dried film)图像。图7A是患有克-雅二氏病的病人(MCJ+)和未患克—雅二氏病的病人(MCJ-)的脑脊液(LCR)样品中蛋白朊病毒经一定量范围的链霉素处理后，经1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：阿利·穆萨，安东尼·威廉·科尔曼，安娜·本奇克雷尼耶，帕特里克·沙阿加尔蒂安，埃尔韦·佩龙，安布鲁瓦兹·马丁，
申请(专利权)人：法国食品卫生安全署，国立科学研究中心，克洛德·贝纳尔里昂大学，生物梅里埃公司，
类型：发明
国别省市：